论文部分内容阅读
研究目的本研究的目的是制备叶酸及二硫键修饰的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)负载治疗肝癌的化疗药物阿霉素(DOX)及疏水性超顺磁性氧化铁(SPIO)的诊疗一体化纳米粒子,并研究此纳米粒子在治疗耐药肝癌中克服多药耐药的能力。我们通过进行体外细胞的实验,拟证实该纳米粒子对耐药肝癌细胞的治疗作用,检测它对耐药肝癌细胞的细胞毒性、靶向性,并进行体外MR成像,从而证实其能成为新型多功能影像对比剂。研究方法:通过将叶酸(FA)及二硫键(-SS-)引入到维生素E聚乙二醇琥铂酸酯(TPGS)中,这将能让制备成的纳米聚合物FA-SS-TPGS具有环境响应性以及靶向功能。同时,由于此纳米聚合物具有两亲性的特性,因此可以将疏水性超顺磁性氧化铁(SPIO)和阿霉素(DOX)包载于此纳米探针中,从而聚合成诊疗一体化的纳米粒子FA-TPGS@DOX/SPIO,FA-SS-TPGS@DOX/SPIO。对FA-TPGS@DOX/SPIO,FA-SS-TPGS@DOX/SPIO的表征:在投射电镜下观察探针的粒径分布,并对疏水性超顺磁性氧化铁(SPIO)和阿霉素(DOX)测试其包载率。最后为了进行T2加权信号的测定我们进行了MR成像,然后再计算测出所制备探针不同的弛豫率。在进一步的体外细胞实验里,用CCK-8法来对TPGS/SPIO,FA-TPGS/SPIO,FASS-TPGS/SPIO空白材料进行生物相容性实验,证实空白材料的生物安全性。为了证明所制备的纳米探针可以顺利进入耐药肝癌细胞,我们选择进行普鲁士蓝染色来加以证明。用CCK-8法对包载了DOX的材料FA-TPGS@DOX/SPIO,FA-SSTPGS@DOX/SPIO,TPGS@DOX/SPIO进行检测,然后于酶标仪上检测吸光度值,而为了验证所制备药物的细胞毒性我们是通过所计算的细胞存活率得出的。另外为了进一步证实细胞毒性,我们还做了Calcein-AM/PI染色。我们再通过DAPI染色及流式技术对细胞摄取、分布进行分析,从而证实胶束的靶向性,通过MR成像对胶束T2信号进行对比。研究结果1、聚合物的制备:通过DLS的测试得知空白FA-SS-TPGS胶束平均粒径大约为95.6 nm,FA-SS-TPGS@DOX/SPIO胶束其平均粒径大约为134.6 nm。而在电镜下观察可知所制备的FA-SS-TPGS对阿霉素及SPIO均有较高的负载能力。同时,FA-SS-TPGS@DOX/SPIO纳米粒子能让DOX更容易释放。2.体外MR成像结果:结果显示当Fe离子浓度的增加,TPGS/SPIO,FATPGS/SPIO,FA-SS-TPGS/SPIO探针的T2信号就会随之逐渐减低;证实该探针可以用作T2对比作用。3.生物相容性实验:结果显示TPGS/SPIO,FA-TPGS/SPIO,FA-SS-TPGS/SPIO空白载体对耐药肝癌细胞毒性较低,同时载体对于耐药肝癌细胞的生物相容性良好,因此可以认为本研究所制备的纳米探针可以用于进一步的实验。4.细胞摄取实验:普鲁士蓝染色实验证实了TPGS/SPIO,FA-TPGS/SPIO,FASS-TPGS/SPIO靶向的探针可被细胞有效摄取。DAPI、流式细胞技术显示TPGS@DOX/SPIO,FA-TPGS@DOX/SPIO,FA-SS-TPGS@DOX/SPIO可以被耐药肝癌细胞摄取并且分布在细胞质中,而游离DOX难以进入耐药肝癌细胞。5.细胞毒性实验结果:实验结果显示TPGS@DOX/SPIO,FATPGS@DOX/SPIO,FA-SS-TPGS@DOX/SPIO靶向的探针制备成不同浓度的溶液,与耐药肝癌细胞共孵育24h后,CCK-8法测得细胞存活率和本研究所研制的药物浓度成反比关系,当药物浓度升高,药物对耐药肝癌细胞的生长抑制作用越显著,而游离DOX对于耐药肝癌细胞生长抑制作用不明显。而Calcein-AM/PI染色分析结果显示,药物浓度越高,对耐药肝癌细胞杀伤作用更强。同时,比起游离DOX,TPGS@DOX/SPIO,FA-TPGS@DOX/SPIO,FA-SS-TPGS@DOX/SPIO的杀伤力更强,而FA-SS-TPGS@DOX/SPIO为三者中最强。结论本研究成功制备了DOX负载的叶酸及二硫键修饰维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)诊疗一体化FA-SS-TPGS@DOX/SPIO纳米粒子,通过多个实验验证此诊疗一体化纳米粒子可用于克服耐药肝癌细胞的多药耐药作用。所制备的纳米粒子具有良好的生物相容性、靶向性,对于耐药肝癌细胞的杀伤力良好,并有MR显影作用,因此具有良好的应用前景。