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目的:制备表面修饰叶酸(FA)的载吉西他滨(Gem)纳米粒子,并进行其形貌、体外释放、胰腺肿瘤细胞靶向摄取和体外细胞毒性实验研究,为将其做为叶酸受体介导的靶向纳米递药系统,从而实现胰腺肿瘤的靶向化疗提供依据。
方法:以FA修饰的壳聚糖(Chi)为载体材料,采用静电喷射法制备具有核壳结构的FA-Chi-Gem纳米粒子,以扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察纳米粒子的形状、粒径、核壳结构等形貌特征;以高效液相色谱法(HPLC)测定FA-Chi-Gem纳米粒子的体外释放情况以及载药量、包封率;应用免疫细胞化学的方法检测叶酸受体(FR)在COLO357、SW1990、CAPAN1、BXPC3、MIA PACA2、L3.6P1等6株人胰腺癌细胞中的表达情况,并选择FR高表达和FR低表达的胰腺癌细胞各一株,应用荧光显微镜观察其对异硫氰酸荧光素(FITC)标记的FA-Chi纳米粒子的摄取情况;以泽菲为参比,通过MTT比色法测定FA-Chi-Gem纳米粒子的胰腺癌细胞毒性。
结果:运用静电喷射法成功制备了FA-Chi-Gem纳米粒子,扫描电子显微镜结果显示粒子为球形,粒径分布范围为200-500nm,平均粒径约为300nm,载药量为3.91±0.12％,包封率为85,37±4.9%,FA-Chi-Gem纳米粒子在pH17.4的PBS溶液中前5小时释放出Gem约41.21%,0.5小时后逐渐进入缓释相,72小时释放率为75.79%,pH5.0的PBS溶液中前.5小时释放出Gem约46.95%,5小时后逐渐进入缓释相,72小时后释放约89.98%。叶酸受体在6株胰腺癌细胞中均有不同程度的表达,其表达水平与胰腺癌细胞的侵袭程度与恶性肿瘤的分期呈正相关;且大部分叶酸受体均分布于胰腺癌细胞膜上,少部分存在于细胞质中。筛选出1株FR高度表达胰腺癌细胞COLO357,1株FR低度表达的胰腺癌细胞BXPC3。体外摄取实验结果表明,COLO357、BXPC3胰腺癌细胞对FA-Chi纳米粒子的摄取显著高于未经FA修饰的Chi纳米粒子。细胞毒性试验显示泽菲对胰腺癌细胞的COLO357、BXPC3的IC50值分别为35.01μg/ml、41.73μg/ml,而FA-Chi-Gem纳米粒子对COLO357、BXPC3的IC50值分别为13.51μg/ml、18.5μg/ml,体现了更强的胰腺癌细胞毒性,且空载纳米粒子无明显细胞毒性。
结论:通过静电喷射法可成功合成具有核壳结构的FA-Chi-Gem纳米粒子,其在生理条件下(pH7.4)的环境中前5小时Gem释放率约为41.21%,而在经细胞内吞后于内涵体pH5.0环境中前5小时Gem释放率约为46.95%,之后都进入缓释相,提示FA-Chi-Gem纳米粒子在内吞入细胞后可较快的释放出Gem。FR阳性的胰腺癌细胞能特异性识别、结合并摄取FA-Chi-Gem纳米粒子,FA-Chi-Gem纳米粒子表现出胰腺肿瘤细胞的靶向性,而叶酸受体-配体结合是其实现靶向作用的主要原理。作为载体FA-Chi空载粒子无明显细胞毒性,FA-Chi-Gem纳米粒子对胰腺癌的细胞毒性明显提高,体现出FA-Chi-Gem纳米粒子在靶向基础上对胰腺肿瘤细胞抑制效果的增强。