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褐飞虱的生长发育离不开骨骼重塑和能量代谢,骨骼的主要成分是几丁质,而能量代谢主要包括糖代谢、糖酵解途径和柠檬酸循环等。谷氨酸盐:果糖-6-磷酸转氨酶(GFAT:Glutamine:fructose-6-phosphate aminotransferase)是己糖胺生物合成途径的第一个限速酶,并参与糖类代谢、几丁质代谢等途径。磷酸果糖激酶(PFK:Phosphofructokinase)是糖酵解通路的限速酶,催化效率不高,故糖酵解的速率严格依赖于PFK的催化能力。在这项研究根据干扰GFAT和PFK基因产生的影响,从而筛选潜在的防治褐飞虱靶标基因。本课题进行的工作内容如下:生物信息学分析:按照生物信息学分析方法分析已知的氨基酸序列,数据显示GFAT和PFK氨基酸序列ORF分别为2112 bp和3378 bp,预测蛋白是大小分别为703个和1125个,预测的蛋白分子量分别为79.22 kD和274.92 kD,等电点分别为6.31和4.82。RNA干扰和差异基因分析:以四龄末五龄初的褐飞虱为干扰对象,通过显微注射法抑制褐飞虱GFAT、PFK基因的表达。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time fluorescent PCR,qRT-PCR)检测关键基因在mRNA上的表达水平。我们对干扰成功的褐飞虱RNA样品进行转录组测序,测序结果表明,注射dsGFAT后,导致上调基因1006个,下调基因8196个;注射dsPFK后导致1498个基因上调,2943个基因下调,其中共有3141个基因同时受GFAT和PFK的调控作用,上调基因有572个,下调基因有2569个。依据差异基因检测结果,我们对其Gene Ontology(GO)功能进行分门别类。结果发现干扰GFAT基因后GO功能分类结果与PFK基因相似,具有催化活性的基因最多,分别为705个和329个;细胞组分中最多的是与细胞相关的序列,分别有367种和162种;介导的生物过程主要是新陈代谢(分别为535种和242种)。抑制GFAT和PFK基因表达对褐飞虱生理生化产生的影响:首先通过qRT-PCR检测褐飞虱GFAT和PFK基因的发育表达和组织表达情况,结果显示GFAT和PFK基因均在成虫阶段的表达水平相对最高,其次是在四龄若虫第三天或五龄若虫第一天的表达量较高。褐飞虱GFAT基因在翅膀中的表达量最高,其次是表皮,这说明GFAT对几丁质代谢具有明显的调节作用,褐飞虱PFK基因在翅膀中的表达水平最高,其次是在头部,在剩余组织中的表达水平较为平稳。接着探究GFAT和PFK基因对几丁质代谢和能量代谢中各个基因的影响。结果显示单独干扰GFAT或PFK基因后,海藻糖酶基因TRE1-1、TRE1-2、TRE2的表达量显著下调,PPGM1、PPGM2、UGPase、GS、GP、HK、G-6-Pase等基因的表达也受到抑制;调低GFAT基因的表达致使褐飞虱体内TRE1酶活显著上升,TRE2酶活先降后升,而海藻糖含量先降后升,葡萄糖含量略有上升趋势,糖原含量先升后降;敲低PFK基因的表达,致使膜结合海藻糖酶酶活明显下降,海藻糖含量无差异表现,葡萄糖和糖原含量显著上升。这些结果说明GFAT和PFK基因能调控褐飞虱海藻糖代谢。当抑制褐飞虱GFAT基因表达后48 h导致几丁质相关基因GNPNA、UAP、PGM1、PGM2、CHS的表达显著下调;在与褐飞虱PFK基因干扰48 h后,GNPNA、PGM2和UAP的相对表达水平显着上调,72 h后,PGM1基因的相对表达量从无显著变化到极显著上升,CHS1、CHS1a和CHS1b的表达也显著上调,GFAT基因的表达量显著下调。并且干扰GFAT和PFK基因后褐飞虱都出现蜕皮异常和翅膀畸形现象,这说明GFAT和PFK基因能有效调控褐飞虱几丁质代谢,其中PFK基因可能通过调控上游海藻糖代谢来控制几丁质合代谢通路,导致几丁质合成困难和蜕皮障碍。无论是干扰GFAT还是PFK基因,HK基因的表达量都显著下调,且ATP含量最终也呈显著下降趋势,这说明GFAT和PFK基因可以通过调低HK基因的表达,从而减缓底物G-6-P的合成,导致ATP含量下降。干扰褐飞虱GFAT基因后褐飞虱体内G6PI1、G6PI2、PFK、PK1-PK5和PK7-PK10基因的相对表达量都不同程度下调,G6PI3基因则极显著上调;PK6表现为先降后升;干扰褐飞虱PFK基因后褐飞虱体内G6PI2、G6PI3、PFK、PK2、PK4和PK7-PK9基因的相对表达量显著下调,而PK10基因则极显著上调;G6PI1、PK1基因的相对表达量先降后升,PK3和PK6基因的相对表达量则先升后降,且PK和MDH酶活性也显著下调与基因的表达保持一致。这些结果表明GFAT和PFK在能量代谢途径中都发挥着重要的作用。