尿路感染(urinary tract infection,UTI)是最常见的感染性疾病之一,极易复发和重新感染,对于在半年内发作2次、1年内发作3次以上的尿路感染,属再发性尿路感染(recurrentant urine tract infections, RUTIs),其反复发作和细菌耐药是临床治疗的关键和难点。寻找安全有效的抗生素替代治疗方案有重要现实意义,这正是发挥中医辨证论治优势所在。严格设计的临床随机对照试验和深入病原学机理研究具有十分重要的意义。本研究在前期临床辨证治疗的基础上,针对再发性尿路感染,开展扶正清热利湿法治疗尿路感染的临床与实验研究,同时对最常见的尿路感染病原菌——尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli, UPEC)的基因型、致病性及耐药性进行了深入研究。本研究分为三部分：(1)扶正清热利湿法辨证治疗再发性尿路感染的临床研究。(2)尿路感染病原学分析——UPEC基因型、毒力基因及耐药谱研究。(3)扶正清热利湿法治疗UPEC尿路感染动物模型的实验研究。第一部分：扶正清热利湿法治疗再发性尿路感染的临床研究[目的]通过平行、随机、对照、盲法的前瞻性临床研究,观察扶正清热利湿法辨证治疗对于再发性尿路感染症状缓解率、细菌清除率、复发及再发率的影响,客观评价扶正清热利湿法对再发性尿路感染的防治疗效。[方法]采用了平行、随机、对照的前瞻性临床研究设计,根据中医辨证标准将符合诊断标准的再发性尿路感染患者分为阴虚湿热证和阳虚挟湿证两层,每层采用区组随机法分为治疗组和对照组,共纳入观察病例90例,其中阴虚证中药组40例,对照组20例,阳虚证中药组20例,对照组10例。阴虚中药组采用滋阴通淋法(通淋1号),阳虚中药组服用温阳通淋法(通淋2号)治疗,疗程4周。对照组根据药敏选用抗生素同时服用安慰剂,疗程1周。共随访6个月。观察扶正清热利湿法辨证治疗对于再发性尿路感染症状缓解率、尿检WBC转阴率、细菌清除率、复发及再发率的影响。[结果]1、对全部入组病例的年龄、发作次数、致病菌种分布情况分析显示,入组患者均为女性,年龄中位数为56.5岁。主要病原菌为革兰氏阴性杆菌。其中最多见为大肠埃希氏菌,占63.8%,该菌种在阴虚证组所占百分比为63%,和阳虚证组(64%)相比无明显差异。分离到大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯、肠球菌属的患者发作次数较高在(>5次/6月)。2、中药组、对照组证候疗效结果显示,中药组痊愈、显效百分比高于对照组,总有效率与对照组相当。其中,阴虚证中药组尿急、尿频、尿道灼痛、尿黄赤混浊、少腹胀痛症状均有极显著改善(P<0.01),尿不尽症状显著改善(P<0.05),西药组治疗前后症状无显著性差异。两组比较,中药组对尿频症状的改善显著优于对照组(P<0.05),其他症状无显著差异。证候学疗效评价结果显示,阴虚证中药组有效率与对照组相当(P>0.05),中药组症状痊愈率高于对照组。阳虚证中药组小便不畅、小腹坠胀、颜面浮肿、肢体浮肿症状改善显著优于对照组(P<0.05),遇劳加剧、大便溏薄症状有极显著差异(P<0.01)。证候学疗效评价结果显示,阳虚证中药组有效率、痊愈率均高于西药组,但无统计学差异。3、两组治疗1周后尿检WBC的转阴率比较结果显示：不管在阴虚证组、阳虚证组还是两证合并后统计,中药组的尿WBC转阴率均显著高于对照组(P<0.001)。4、不管在阴虚证组、阳虚证组还是两证合并后统计,在治疗第14d,中药组细菌清除情况优于对照组,而随监测时间延长,两组差异越来越小,在疗程结束时,两组细菌清除率相当。比较两组大肠埃希氏菌(Ecoli)感染RUTIs患者的细菌清除情况,在治疗第14d,中药组细菌清除情况显著优于对照组(P<0.05),而随监测时间延长,两组差异越来越小,在疗程结束时,两组细菌清除率相当。对于产超广谱β-内酰胺酶(EBSL)大肠埃希氏菌、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRSCON)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE),中药均可有效清除(75%),对照组未能清除。5、随访6个月后统计两组复发率,中药组复发率均低于对照组,阴虚证组有显著性差异(P<0.001)。[结论]1、再发性尿路感染主要致病菌为大肠埃希氏菌,该菌也是引起反复发作的主要致病菌。2、扶正清热利湿法辨证治疗对于部分阳虚证候的改善显著优于西药组,对于阴虚证候的疗效不劣于西药组,特别对于湿热下注证候疗效显著。中药总体证候疗效不劣于西药组。3、扶正清热利湿法辨证治疗有助于促进炎症恢复,减少组织损伤。4、扶正清热利湿法辨证治疗对于致病菌的清除效率高于西药组,总体清除能力不劣于西药组。同时能够有效清除产耐药酶菌株。5、扶正清热利湿法辨证治疗防止尿路感染再发疗效优于西药组。第二部分尿路感染病原学分析----UPEC分离株的基因型、毒力基因及耐药谱研究[目的]针对再发性尿路感染最常见致病菌UPEC,通过对其基因型及遗传多态性、致病性(毒力基因分布)、耐药性以及三者之间相关性的研究,探讨UPEC致病和耐药的病原学特征及其可能的生物学机制。[方法]采用重复序列PCR (rep-PCR)指纹分析技术,通过对模板制备、扩增条件和电泳条件等的优化,建立UPEC的Rep-PCR分型方法,对我院分离的205株UPEC菌株进行Rep-PCR分型,了解是否存在亲缘相近的基因型组和基因多态性。选取在UPEC中有广泛分布的24个毒力基因,设计合成引物,在分离株中筛选毒力基因,了解各分离株的毒力基因分布情况。采用药敏纸片法测定UPEC临床分离株对常见的17种抗生素的耐药谱。综合细菌的基因型、毒力基因分布和耐药谱,分析三者之间的关系,探讨UPEC致病和耐药的生物学机制。[结果]1、通过条件的摸索和优化,建立了UPEC分离株的Rep-PCR分析方法。2、205株UPEC分离株经Rep-PCR分析,共分出了158个分支,这些型聚类为A到H共8个基因组群。3、毒力基因筛选结果显示,已知的24个毒力基因中我们检测到15个,最常见的为Fimh、traT、AerJ、papGⅢ、PAI、 fyuA、PapG,且各毒力基因在分离株中的分布存在显著差别。4、耐药谱分析结果显示,耐药率(未计入中度耐药)最高的是派拉西林,耐药率为78.54%,其次是庆大霉素、左氧氟沙星、头孢唑啉,分别为66.34%、65.37%和50.24%。不同科室的UPEC分布和耐药性存在较大差异。5、各基因型组主要毒力基因分布情况相似,E、F组携带毒力基因较少,但各基因型组的耐药性无明显差异。6、毒力基因数量与EBSL、耐药率呈显著正相关,其中traT与耐药呈极显著正相关,PAI与敏感性呈显著负相关,某些毒力基因之间也存在一定相关性。[结论]1、UPEC分离株基因型别众多,存在遗传多态性,其主要基因型的菌株在各科室均有流行。2、UPEC对多种抗生素均耐药,表现为多重耐药和泛耐药。3、UPEC的致病相关毒力基因与耐药性存在显著正相关,携带毒力基因越多,耐药性越强。4、UPEC基因型与耐药性之间未发现显著相关性,提示其耐药性可能通过质粒水平向快速传递获得为主。第三部分：扶正清热利湿法治疗UPEC尿路感染Balb/c小鼠模型的实验研究[目的]根据毒力基因分布和耐药性分析,选择致病性强、泛耐药、产EBSL的UPEC菌株,建立Balb/c小鼠尿路感染模型。采用扶正清热利湿方和亚胺培南(IPM)分别对小鼠模型进行干预,评价中药对多重耐药UPEC尿路感染小鼠模型的治疗作用以及对UPEC耐药性的影响。采用体外抑菌试验,分析中药的抑菌/杀菌作用。[方法]根据UPEC毒力基因和耐药性分布,选取UPEC分离株,分别以高、中、低剂量量(1×109,1×108和1×107cfu)尿路感染Balb/c小鼠,感染后观察小鼠精神状态和死亡情况,对尿液中分离细菌计数,分析尿液中排菌情况；将造模成功的小鼠模型随机分为中药高、低剂量组、抗生素组和模型对照组,分别给予中药和IPM治疗,正常小鼠作空白对照组,观察治疗后各组小鼠死亡情况和存活小鼠精神状态,分析尿液、脾、肾、膀胱中细菌数变化,分析各组小鼠脏器指数,综合分析比较各组疗效。对治疗后分离的细菌的耐药性进行分析,比较中药与抗生素对细菌耐药性的影响。通过体外抑菌试验,分析中药及抗生素原药及含药血清对UPEC201菌株的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度。[结果]1、选取了UPEC201菌株(携带主要毒力基因、仅对亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦敏感)作为造模用菌株。选取高剂量(1×109)为造模剂量,建立了UPEC201菌株的UTI小鼠模型。该剂量下小鼠感染后死亡率为33.4%,感染后第21天仍能检测到细菌。2、与模型对照组相比,治疗后各治疗组小鼠死亡率降低,高剂量组、低剂量组和抗生素组的治愈率分别为80%、40%和80%。各治疗组小鼠的精神状态明显好于模型组,在观察结束时精神状态可恢复到正常小鼠状态。3、细菌计数结果显示,各治疗组疗后尿菌计数显著下降,在治疗后第7天,高剂量组和抗生素组尿液中细菌完全清除。而脏器中的细菌并不能被清除。第14d,中药高剂量组膀胱、脾脏细菌计数均低于模型组和抗生素组,尿液、肾脏的细菌计数与抗生素相当。4、各治疗组小鼠的脏器指数与模型组相比降低,其中高剂量组与抗生素组的脏器指数相当。5、中药治疗后,细菌的耐药性发生了变化,对多种抗生素的敏感性增加,质粒分析显示,经过治疗后小鼠的细菌的部分质粒得到清除。6、中药的体外抑菌试验结果显示,中药对UPEC201菌株的最低抑菌浓度为250mg/ml,未发现杀菌作用。经灌胃小鼠制备的含药血清对细菌没有抑菌作用,但体外制备的含有中药的血清对抑菌有抑制作用,测得最低抑菌浓度降低为125mg/ml。[结论]1、扶正清热利湿方对高致病、多重耐药UPEC尿路感染小鼠模型具有治疗作用,与亚胺培南的疗效相当；2、中药和亚胺培南均不能彻底将UPEC从模型小鼠体内完全清除,这可能是UPEC引起再发的原因。3、中药高剂量组膀胱、脾脏细菌计数均低于模型组和抗生素组,尿液、肾脏的细菌计数与抗生素相当,提示中药可能对于抑制UPEC在脏器寄生的作用优于抗生素。4、中药治疗后小鼠模型脏器指数低于模型对照组,与抗生素组相当,提示在改善感染后脏器炎症损伤方面中药与抗生素疗效相当。5、扶正清热利湿中药能够通过消除致病菌的某些质粒一定程度降低细菌的耐药性,使其对多种抗生素的敏感性增加。6、扶正清热利湿中药体外对UPEC具有抑菌作用。[创新点]1、首次采用严格设计的平行、随机、对照、盲法的前瞻性多中心临床研究,系统观察了扶正清热利湿法辨证分型对改善再发性尿路感染患者中医证候、炎症消除、减少复发的作用,并进行了疗效评价。2、采用重复序列PCR (rep-PCR)指纹分析技术,对引起尿路感染最常见的致病菌——UPEC进行了基因型、致病性和耐药性分析,发现UPEC具有遗传多态性,其基因型与耐药性和毒力基因之间没有显著关系,而毒力基因与耐药性呈显著正相关,提示UPEC的耐药性以水平向获得为主。3、利用高致病性、多重耐药UPEC201菌株建立了UPEC尿路感染Balb/c小鼠模型,并研究了扶正清热利湿中药对该模型的治疗作用。关于该模型的研究在国内未见报道。4、通过观察分析治疗后小鼠模型脏器内未清除细菌的耐药性及质粒的变化,研究了扶正清热利湿中药治疗对UPEC耐药性的影响。结果显示中药治疗后,UPEC的耐药性下降,质粒分析显示治疗后部分质粒得到消除。