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目的：大前庭水管综合征(large vestibular aqueduct syndrome, LVAS或enlarged vestibular aqueduct syndrome, EVAS)是以前庭导水管扩大伴有感音神经性聋(SNHL)为特征的一种常染色体隐性遗传性非综合征型听力障碍性疾病。目前研究表明,大前庭水管与SLC26A4基因突变有关,是由Everett等在一个常染色体隐性遗传性疾病--Pendred综合征的家系中首先发现的。近年来国外的多项研究表明SLC26A4基因突变与Pendred综合征和单纯前庭水管扩大和或内耳畸形有密切的关系。据估计,世界范围内儿童语前聋患者中4%～10%由Pendred综合征导致,我国Pendred综合征的报道还较少,但前庭水管扩大在耳聋患者中占有相当的比例。SLC26A4基因编码含有780个氨基酸的蛋白质Pendrin, Pendrin是一种跨膜蛋白,对S042-、HCO3-、I-、Cl-.甲酸根离子等多种单价或二价离子进行转运,在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。因该基因较大(开放阅读框架2343bp),外显子多达21个,其突变谱广,据报道截至2010年突变多达160种,Pendrin主要表达于甲状腺,在内耳、胎肾和胎脑中也有分布。在内耳,Pendrin表达于内淋巴管、内淋巴囊、椭圆囊、球囊等处。Everett等发现在胚胎13天,小鼠内淋巴管和内淋巴囊就有SLC26A4基因mRNA的强表达,淋巴管和内淋巴囊与内淋巴液代谢有关,内淋巴液的酸碱平衡主要由H(+)-ATPase和C1(-)/HCO3(-)维持。Pendrin很可能作为Cl(-)／HCO3(-)转运体调节内淋巴液的离子平衡,同时作为HCO3(-)转运体将血管纹空间的HCO3(-)分泌入内淋巴液,HC03(一)的堆积将限制保护性谷胱甘肽的产生从而增加自由基压力,HC03(一)的移除有助于保护血管纹免受自由基损伤,维持其正常功能。关于SLC26A4基因突变引起疾病表型的具体机制目前还没完全明了。2008年发表于JMG的一项韩国研究认为不同突变通过不同机制导致Pendrin蛋白构象和离子转运功能障碍,该研究发现大多数突变的异常蛋白产物滞留在细胞内,而野生型蛋白表达在胞浆膜,从而影响了C1(-)/HC03(-)离子交换功能。此外,突变蛋白也表现出明显的异质性,例如H723R突变蛋白产物主要存在于细胞的内质网,低温孵育下这种蛋白产物的异常修饰及受损害的离子转运功能能很大程度的恢复,L236P突变蛋白产物则主要停留在细胞的中心体区,对同样的温度治疗不敏感。聋病分子流行病学调查显示该基因变异在中国耳聋人群中具有广泛的异质性,其中部分突变在其他人种未见报道。那么,新变异是否能引起确切的疾病表型亟待功能研究证实。本研究拟建立一套SLC26A4基因新变异致病性鉴定系统以分析新发现变异及其致病性,在蛋白水平探讨SLC26A4基因致聋机制,阐释中国人群特异的SLC26A4基因型表型相关性,指导临床SLC26A4相关耳聋的基因诊断及产前诊断。方法：1.克隆野生型SLC26A4,并其构建于pEGFP-N1质粒上,使其能表达Pendrin融合蛋白设计引物扩增SLC26A4基因cDNA序列,将其与pCRⅡ-TA质粒连接。随后将目的基因构建于pEGFP-N1质粒上,使其能表达Pendrin融合蛋白2. SLC26A4基因定点诱变,克隆变异型SLC26A4,并其构建于pEGFP-N1质粒上,使其能表达变异的Pendrin融合蛋白针对上述最有可能影响Pendrin蛋白功能的10种SLC26A4基因变异分别设计包含碱基变异位点的一对引物(正、反),应用发展成熟的QuikChange Site-directed Mutagenesis试剂盒进行定点诱变。与模板质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”,正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物,由于原来的模板质粒来源于常规的大肠杆菌,是经dam甲基化修饰的,Dpn I敏感而被切碎,而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开,因此在随后的转化中得以成功转化,即可得到突变质粒的克隆,并突变质粒进行测序筛选验证。将克隆得到的变异型SLC26A构建于pEGFP-N1质粒上,使其能表达变异后异常Pendrin融合蛋白3.将野生型SLC26A4及各种变异型SLC26A4分别转染HEK293细胞和HeLa细胞培养HEK293细胞和HeLa细胞,应用转染试剂盒,将野生型SLC26A4及各种变异型SLC26A4分别转染HEK293细胞和HeLa细胞,以分析绿色荧光蛋白(GFP)的荧光信号来鉴定转染效率。正常的HeLa细胞内无Pendrin表达,转染野生型SLC26A4及各种变异型SLC26A4后,可以利用免疫荧光技术通过激光共聚焦显徼镜观察野生型Pendrin及各种异常型Pendrin在HeLa细胞内的定位。在HEK293细胞细胞内观察野生型Pendrin及各种异常型Pendrin对甲酸根离子转运能力。4.用同位素标记法测量细胞内的甲酸根离子。结果：1.构建的野生型质粒pEGFP-SLC26A4经测序后,与NCBI的GenBank上发布的NM000441.1比较序列完全一致。2.野生型pEGFP-SLC26A4质粒通过转染细胞表达Pendrin融合蛋白后,Western Blot检测出87kDa(?)小的蛋白。3.通过将各种质粒转染细胞后发现,野生(?)SLC26A4基因表达产物Pendrin表达于细胞膜上,各突变型SLC26A4基因表达产物Pendrin有的表达于细胞膜上,有的表达于细胞质内,有的在细胞膜和细胞质内均有表达。4.通过同位素标记法测量出各种转染后细胞内的甲酸根离子,实验显示突变基因表达的Pendrin蛋白对于甲酸根离子的转运效率发生了不同程度的下降。结论：1.本研究的突变型SLC26A4表达产物Pendrin蛋白在细胞内的定位发生改变,有的表达于细胞膜上,有的表达于细胞质内,有的在细胞膜和细胞质内均有表达,这也是其转运功能发生改变的基础。2.本研究的10种突变型SLC26A4表达产物的转运功能均有不同程度的下降,即使有的突变型SLC26A4表达产物Pendrin蛋白表达于细胞膜上,其编码的Pendrin蛋白无法完成正常的阴离子交换功能,对甲酸根离子的转运功能有不同程度的下降,从而导致耳聋的发生。