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豆科植物与根瘤菌共生固氮是自然界中最为高效的一种生物固氮体系。在土壤环境中,豆科植物会遇到很多正常结瘤但固氮能力不同的根瘤菌,宿主植物能否对根瘤菌固氮能力的差异做出反应,从而建立和维持稳定的共生关系?已在大豆、含羞草等植物中发现宿主限制根瘤内非固氮根瘤菌增殖、类菌体分化等生理和形态学现象,但对其响应机理却研究甚少。因此本实验以形成定型根瘤非终端分化类菌体的菜豆作为宿主植物,利用甲苯胺蓝染色技术、透射电子显微镜观察和转录组测序等多种手段来研究宿主对不同固氮能力根瘤菌的生理响应机理。实验室前期研究发现菜豆根瘤菌Rhizobium etli CFN42（wild type-WT）与nifHa/bDK突变菌株（ΔnifHa/bDK,固氮缺失株）1:1共同接种到菜豆植株根部后,菜豆对固氮缺失株ΔnifHa/bDK在根瘤数量的形成上有一定的限制作用,ΔnifHa/bDK菌株单独占瘤率一直处于较低水平,而WT菌株的单独占瘤率逐步升高,最终达到80%,表明菜豆可以识别固氮缺失株ΔnifHa/bDK并作出一定的反应。本论文主要是在WT和ΔnifHa/bDK单独接种的条件下,研究菜豆对菜豆根瘤菌CFN42固氮缺失株ΔnifHa/bDK的生理响应机制,主要结果如下:（1）为研究nifHa/bDK对菜豆根瘤菌CFN42-菜豆结瘤固氮的影响,首先分别测定野生型菌株CFN42单独接种、固氮缺失株ΔnifHa/bDK单独接种和二者1:1混合接种宿主菜豆后2-5周的根瘤固氮酶活性,结果显示单独接种ΔnifHa/bDK根瘤的固氮酶活性丧失,单独接种WT和WT与ΔnifHa/bDK混合接种的植株,3周龄根瘤固氮酶活性最高,达到20000 μmol C2H4/hr/g以上,此后随植株生长趋势逐渐下降。其次分别对WT、ΔnifHa/bDK单独接种和二者1:1混合接种植株的结瘤情况进行检测,结果显示,第6周,WT单独接种与两种菌株1:1混合接种植株的根瘤数量均在120颗/株左右,而单独接种ΔnifHa/bDK植株的根瘤数量达到220颗/株左右,产生超结瘤现象,与单独接种WT植株的根瘤数量间存在显著差异（P<0.0001）,从植物对氮源的需求角度看,接种ΔnifHa/bDK植物无法获得足够的氮源,所以植物产生更多的根瘤以期获得足够的氮源。（2）为研究菜豆对菜豆根瘤菌CFN42固氮缺失株ΔnifHa/bDK的生理响应,首先利用超景深体式显微镜对菜豆根瘤的颜色形态进行观察,接种ΔnifHa/bDK的2周龄根瘤呈白色,后期颜色逐渐加深,第4周根瘤颜色已变为棕褐色,部分根瘤甚至出现中空皱缩（典型的根瘤衰老现象）,而接种WT的2周龄根瘤呈粉红色,到第4周大部分根瘤颜色依然呈粉红色,具有固氮能力,表明ΔnifHa/bDK形成的根瘤出现提前衰老现象。分别对单独接种WT和ΔnifHa/bDK根瘤中的菌体数量进行检测,从而比较两种不同固氮能力的根瘤菌在宿主适应性上的差异,结果显示,2-5周,接种WT根瘤中的菌体数量高于接种ΔnifHa/bDK根瘤中的菌体数量,两者之间存在显著性差异,接种WT根瘤中的平均菌体数量在第4周达到最高,而接种ΔnifHa/bDK根瘤中的平均菌体数量在第2周达到峰值,随后逐渐降低,第5周时近1/6的根瘤中已检测不到该菌株,表明WT在宿主根瘤中的适应性明显优于ΔnifHa/bDK。通过对甲苯胺蓝染色的根瘤切片观察发现,接种WT的2周龄根瘤,侵染细胞发育良好、形态饱满可见液泡,而接种ΔnifHa/bDK的2周龄根瘤中,部分侵染细胞的液泡破裂,第4周ΔnifHa/bDK的侵染细胞与WT相比发生不规则变形、皱缩,且大多数侵染细胞内,液泡发生破裂,表明ΔnifHa/bDK侵染的宿主细胞出现提前衰老。利用透射电子显微镜对WT和ΔnifHa/bDK分化的类菌体进行形态观察,发现接种ΔnifHa/bDK的2周龄根瘤细胞的共生体膜发生分解,到第4周大部分共生体膜都已分解,并且出现细胞破裂、类菌体被释放到细胞间隙的现象,表明ΔnifHa/bDK菌株的侵染细胞逐渐凋亡,而在接种WT的根瘤切片中没有发现该现象。以上结果表明菜豆通过降低根瘤内固氮缺失株的菌体数量或迫使根瘤提前衰老从而对ΔnifHa/bDK产生一定的限制或制裁,以维持共生关系的稳定。（3）为探究菜豆对菜豆根瘤菌CFN42固氮缺失菌株ΔnifHa/bDK的生理响应机制,采用RNA-Seq技术对单独接种WT和单独接种ΔnifHa/bDK的菜豆根瘤RNA进行测序分析,结果发现与单独接种WT相比,单独接种ΔnifHa/bDK处理下,5977个基因的表达水平发生了显著变化（| log2 ratio |≥1）,其中3264个基因上调表达,2713个基因下调表达。对差异表达基因进行KEGG pathway富集分析,发现差异表达基因主要富集在植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、苯丙氨酸代谢、植物病原互作、碳代谢、糖酵解/糖异生、细胞凋亡、氮代谢等途径中。对RNA测序结果进一步分析发现,在接种ΔnifHa/bDK 根瘤内,PR1 Phvul.006G196900、PR4 Phvul.006G102300、PAL Phvul.008G289500、R Phvul.004G115600、WRKY29 Phvul.002G293200、WRKY70 Phvul.005G080400等防御相关基因上调表达（log2 ratio分别为2.35、2.14、2.48、13.66、2.36、16.18）,表明宿主菜豆对固氮缺失株ΔnifHa/bDK存在明显的免疫抑制作用。衰老相关基因SAG29 Phvul.008G001100、植物细胞凋亡关键基因半胱氨酸蛋白酶Caspase3 Phvul.002G21 0000上调表达（log2 ratio 分别为 15.41 和 2.33）,表明接种ΔnifHa/bDK根瘤较接种WT根瘤相比发生提前衰老。编码WRKY、bZIP、MYB、bHLH转录因子的基因Phvul.005G080400、Phvul.009G0-38000、Phvul.007G069400、Phvul.009G189200上调表达（log2 ratio 分别为 16.18、14.38、14.08、15.51）,表明转录因子在宿主对固氮缺失株ΔnifHa/bDK的生理相应中发挥重要作用。编码苯丙氨酸解氨酶（水杨酸合成关键酶）、1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（乙烯合成关键酶）、脂氧合酶（茉莉酸合成关键酶）的基因Phvul.008G289500、Phvul.007G135600、Phvul.010G135300上调表达（log2ratio分别为2.48、6.43、4.02）,表明植物激素参与菜豆对固氮缺失株ΔnifHa/bDK的生理响应。编码类钙调蛋白（Ca2+信号转导途径关键蛋白）、谷胱甘肽过氧化物酶（活性氧清除酶）的基因Phvul.007G175400、Phvul.007G169601上调表达（log2 ratio分别为17.06、14.92）,表明Ca2+信号途径及活性氧水平在宿主对固氮缺失株ΔnifHa/bDK的生理响应具有重要作用。选取10个差异表达基因进行qRT-PCR检测,结果显示,10个基因qRT-PCR的检测结果与RNA-Seq分析结果一致,证实了 RNA-Seq分析结果的可靠性。根据RNA-Seq分析结果,对根瘤内水杨酸含量进行测定,以验证植物水杨酸途径是否发生变化。结果发现接种WT的4周龄根瘤内水杨酸含量为18.40 pmol/g,而接种ΔnifHa/bDK的4周龄根瘤内水杨酸含量25.79pmol/g,显著升高。以上结果表明菜豆对菜豆根瘤菌CFN42固氮缺失菌株ΔnifHa/bDK的生理响应是植物激素信号转导、Ca2+信号转导、活性氧信号分子和多种转录因子家族共同参与的过程。综上所述,菜豆对固氮缺失株ΔnifHa/bDK的生理响应主要出现在根瘤形成三周后,会强烈地控制ΔnifHa/bDK的菌体数量,通过降低根瘤内ΔnifHa/bDK的菌体数量或迫使根瘤提前衰老产生一定的限制或制裁,菜豆对菜豆根瘤菌CFN42固氮缺失株ΔnifHa/bDK的生理响应是植物激素信号转导、Ca2+信号转导、活性氧信号分子和多种转录因子家族共同参与的过程,但复杂的调控网络还有待研究。