视网膜视神经疾病是主要的致盲性疾病,主要特点为视网膜节细胞(retinal ganglion cell,RGC)及其纤维的渐进性死亡。目前,视网膜视神经疾病尚缺乏有效的治疗手段。RGC及其纤维渐进性死亡机制是神经损伤与再生研究的难点和重点,一直为国内外研究者广泛重视和关注。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是细胞内分泌型及膜性蛋白合成并形成正确三维结构的场所。ER内的蛋白折叠微环境遭到破坏可导致错误折叠蛋白的产生,当其超过了一定限度,会触发细胞产生非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。中枢神经系统的神经元及成髓鞘的少突胶质细胞,由于自身的特性,需要合成大量的膜蛋白,因而对各种应激刺激非常敏感。已有研究发现,UPR现象是中枢退行性变性疾病神经元丢失的最早原因,如帕金森斯病、早老性痴呆等。最近Ryoo等发现,干扰果蝇视网膜RGC的蛋白折叠进而引发UPR,可导致视神经迟发变性死亡,提示UPR也可能是视网膜RGC及其纤维渐进性死亡的首发病理机制。但上述研究均建立在明确细胞内有变性蛋白的基础上,对外伤等原因导致的神经元丢失尤其是视神经损伤是否存在该现象尚缺乏研究。本实验室首先发现视神经钳夹损伤可导致RGC发生UPR,并且与变性神经元染料—Fluoro-Jade C存在共存现象,在此基础上,本研究采用免疫电镜结合胶体金标记技术进一步研究视神经钳夹损伤后,RGC以及视神经少突胶质细胞内UPR,旨在探索视网膜神经细胞及其纤维渐进性死亡机制。目的:1.研究大鼠视神经夹伤后RGC的非折叠蛋白相关因子(IRE-1)的表达,观察RGC层的变性神经元并分析其与IRE-1的关系。2.采用免疫电镜双重标记技术,研究大鼠视神经夹伤后RGC以及少突胶质细胞内UPR,探讨UPR与细胞变性的关系,旨在探索视网膜神经细胞及其纤维渐进性死亡机制线索。方法:实验一:建立大鼠视神经夹伤模型并行视觉电生理检查1.建立大鼠视神经夹伤模型显微镜下暴露成年雄性SD大鼠视神经,反向镊于球后2mm夹伤视神经,夹持时间为20s。2.视觉电生理检查分别检测正常大鼠及视神经夹伤后4h,8h,12h,1d,3d,7d损伤眼F-VEP、ERG变化。实验二:大鼠视神经损伤后视网膜、视神经形态学变化1.将对照组(4只)、损伤组(夹伤后不同时间组即4h,8h,12h,1d,3d,7d,共6组,每组4只)大鼠灌注,按上述时间点制备视网膜、视神经冰冻切片。2.常规HE染色,光镜下观察视网膜节细胞、视神经的时空变化。3.神经节细胞计数每个标本在高倍镜视野下观察10～15个视野,对视网膜神经节细胞计数。实验三:大鼠视神经损伤后细胞变性与非折叠蛋白反应免疫荧光组织化学方法观察IRE-1及Fluoro-Jade C染色。实验四:大鼠视神经损伤后免疫电镜研究1.建立大鼠视神经夹伤模型,分为夹伤后12h,1d,3d,5d,共4组。2.采用免疫电镜双标技术,观察视网膜中UPR相关因子IRE-1和AMPA受体,以及IRE-1和少突胶质细胞免疫荧光双标。结果:1.在建立大鼠视神经夹伤模型中,未发现伤口感染及眼底缺血表现。2.视觉电生理检查:正常大鼠F-VEP峰潜时为62.00±1.65ms、波幅为19.17±2.03μV,视神经损伤后各时间点P100波峰潜时均较正常大鼠缩短,至12h时最短,对比正常差异显著,而后逐渐延长,1d时已长于正常水平;波幅在损伤后明显下降,各时间点均低于正常水平,4h、1d、3d、7d具有极显著差异。伤后峰潜时在最大反应b波4h、8h和12h,明适应ERG的b波各时间点,闪烁反应12h,相比正常明显延长,差异具有显著性。伤后波幅在最大反应b波4h、8h、12h、3d明显降低,具有极显著性差异,振荡电位O2波在1d、3d、7d时升高,具有显著性差异,明适应视网膜电图在12h时下降,具有显著性差异。3.形态学观察:大鼠视神经夹伤后,视网膜神经节细胞层胞核明显稀疏,夹伤后4h、8h不明显,特别是在夹伤后期(1d、3d、7d),这种病理表现愈加明显,胞浆成分疏松,节细胞层有散在的核染色质边聚、空化的节细胞,大而浅染的细胞核明显减少,甚至消失,小而深染的细胞核减少,内核层细胞和外核层细胞数目明显减少,核排列不致密,内网状层明显变薄,视网膜总厚度变薄,夹伤后7d较明显。夹伤后7d,节细胞数减少幅度增大。夹伤后4h,8h视神经纤维出现连续性中断;夹伤后12h,1d,视神经干出现明显夹伤的断裂带,伴有出血;夹伤后3d,出血、断裂带呈现扩大化的表现,出现格子细胞浸润;夹伤后7d,出血消失,大量细胞坏死。4.免疫组织化学观察:Fluoro-Jade C染色在视神经夹伤后1d、3d、5d的各个时间点,RGC层胞核排列疏松,排列紊乱,视网膜各层界限较清晰,均可见IRE-1与变性神经元在RGC层表达(红色标记),尤其夹伤后1d组出现IRE-1在视网膜节细胞组织表达增强,并且在夹伤后3d组IRE-1强表达细胞与染色中枢神经变性细胞的染料FJC染色存在共存(黄色标记),夹伤后5d表现更为突出,广泛分布于RGC层、外颗粒层。同时,在夹伤后1d、3d、5d各组FJC染色损伤变性细胞在RGC层表达(绿色标记),夹伤后1d组FJC浅染,夹伤后3d组FJC深染,同时内核层个别双极/无长突细胞也出现Fluoro-Jade C阳性反应。在夹伤后3d、5d组双标百分比分别增至39.47±12.13%,49.36±9.35%,P<0.01,具有明显差异.5.透射电镜观察:正常及夹伤后少突胶质细胞的超微结构,前者膜结构形态正常,层次清楚,边缘清晰;后者线粒体肿胀,嵴断裂,空泡样变,内质网存在包涵体样物质,出现蛋白沉积,髓鞘结构疏松,空泡化,增生加重,典型UPR形态学的表现。正常髓鞘致密光滑,排列规整。视神经夹伤后,出现髓鞘的改变:损伤后髓鞘板层紊乱,排列疏松,髓鞘扭曲,空泡性变。同时可见神经节细胞内质网扩张,线粒体肿大。电镜下观察到金颗粒见于RGC,呈单个散在或几个颗粒聚集分布,清晰地勾勒出细胞轮廓,胞浆内也有少量金颗粒存在,多分布在粗面内置网上。除此之外,金颗粒出现在少突胶质细胞上。高电子密度的DAB反应过氧化物酶免疫反应产物呈茸毛状均匀地分布于少突胶质细胞,可见圆形、清亮的突触小泡以及线粒体等细胞器。6. IRE-1在RGC内的分布:在视神经钳夹后,胶体金标记IRE-1在RGC内的分布均明显增多,对照组18.4±5.1个、12h组30.4±7.2个、1d组为35.1±6.4个、3d组48.5±9.7个、5d组46.5±9.3,与对照比较,12h组有显著增多(p<0.05),1d、3d、5d组均有显著差异(p<0.01)。在每个胶体金与最近内质网直线距离上,对照组-1.1±2.2nm、12h组8.8±2.7nm、1d组18.8±2.0nm、3d组19.4±5.7nm、5d组18.6±3.0nm,与对照组比较,12h、1d、3d、5d组均有显著意义(p<0.01)。IRE-1在少突胶质细胞内的分布:胶体金标记为IRE-1,视神经钳夹后,CNPase标记(少突胶质细胞身份标志)细胞内胶体金数目明显增多,对照组12.3±3.5个、12h组17.4±3.2个、1d组为35.1±6.4个、3d组39.0±13.3个、5d组38.1±10.6个,与对照比较,12h组有增多趋势但无统计学意义(p>0.05),1d、3d、5d组均有非常显著意义(p<0.01)。在每个胶体金与最近ER直线距离上,对照组0.3±1.6nm、12h组8.5±2.4nm、1d组14.8±4.1nm、3d组15.3±5.1nm、5d组17.3±5.1nm,与对照组比较,12h、1d、3d、5d组均有非常显著意义(p<0.01)。结论:1.视神经损伤后RGCs数量减少是引起视觉电生理改变的原因。2.视神经损伤可导致少突胶质细胞及RGC产生UPR,UPR发生早于RGC的丢失,且发生UPR的RGC是处于变性过程中。3.视神经钳夹导致视神经干上的少突胶质细胞以及RGC内IRE-1分布部位异常以及胶体金标记数目增加,表明视神经钳夹能导致这些细胞触发UPR,可能是视神经钳夹损伤后RGC及其纤维渐进性死亡发生原因。