肝纤维化是机体对所有慢性肝脏疾病的一种主动的损伤修复反应,特点为细胞外基质的过度沉积,发展到晚期表现为肝脏内纤维胶原弥漫性分布,原有的规则有序的小叶结构遭到破坏,代之以再生结节,即为肝硬化。肝硬化将导致肝衰竭、门脉高压、腹水等多种严重的并发症。全世界每年有140万人死于肝硬化,肝硬化居全美死亡原因的第七位。由于缺乏安全有效的预防和治疗药物,一旦发展到肝硬化阶段,唯一有效的治疗手段就是肝移植。因此,在早期阶段,即肝纤维化阶段进行干预就显得尤为重要。　　抗肝纤维化的环节主要包括去除病因,抗炎抗氧化,抑制细胞外基质的产生和促进细胞外基质的降解。目前的抗肝纤维化药物主要包括γ-干扰素(IFN-γ)、秋水仙碱、青霉胺等抑制胶原合成的药物,但其治疗效果并不理想。中医理论认为肝纤维化的发病机制为多方面原因致肝络阻塞、血瘀气滞,以致肝脾失养,升降失司,水湿停留,腹内积块和腹水相继而成。其辨证以脾虚或肾虚为本,瘀血或兼有气滞为标。其治疗针对病因以扶正化瘀、攻补兼施为主。治法上多采用健脾养肝补肾,随症加用活血行气、软坚化瘀、利水之品。国内文献报道的中医药复方,如扶正化瘀胶囊、复方鳖甲软肝片等显示出了较好的疗效,提示中医药可能成为抗肝纤维化的优先选择。　　花芝肝泰(HZGT)胶囊是由灵芝、五味子等中药组成的复方制剂,临床应用治疗肝硬化亦取得较好的疗效,但其药理作用特点、作用机理和药效物质基础均不清楚。因此,本课题建立并优化了CCl4诱导肝纤维化模型和ConA诱导的急性肝损伤模型,观察了花芝肝泰对模型的治疗作用并对其作用机制进行了初步的研究。　　一、CCl4致肝纤维化模型的建立　　肝纤维化动物模型按成因不同可分为化学性毒物诱导模型,免疫性肝损伤模型、胆汁淤积性肝纤维化模型等。其中化学毒物四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)诱导的肝纤维化模型是使用最广泛的肝纤维化模型,具有和人类肝纤维化相似的病理改变以及简便易行等特点。其原理是 CCl4在肝细胞微粒体氧化酶的作用下生成三氯化碳自由基攻击肝细胞,引起肝细胞的坏死,反复用CCl4攻击引起慢性炎症而导致肝纤维化的形成。该模型的成模时间、成模率、死亡率文献报导很不一致,根据CCl4的给予量、给药途径、动物品系的改变而有所不同。　　本研究主要对 CCl4的剂量、给药途径和动物种属等造模条件对模型的成模率和死亡率的影响进行了考察。　　考察剂量时,CCl4设定0.5、0.75、1.0 ml/kg三个剂量,采用腹腔注射进行,2次/周,共8周,于第9周开始停止注射CCl4,观察至第12周;考察给药途径时采用相同剂量的CCl4腹腔注射或灌胃,2次/周,共12周;考察动物种属时,选择ICR小鼠和SD大鼠,相同剂量的CCl4灌胃,2次/周,共12周。观察动物的体重、血清ALT、TP、ALB、HA和生存曲线随造模时间的变化,采用苏木精-伊红和马松三色染色观察肝脏病理改变。　　实验结果表明,选用不同剂量的CCl4腹腔注射后,在第10周,0.5 ml/kg CCl4造模仅在汇管区形成纤维化,0.75 ml/kg CCl4则形成了纤维间隔,而1 ml/kg CCl4造模形成的纤维间隔将肝脏分割成块,即晚期肝纤维化(advanced liver fibrosis),提示合适的CCl4剂量为1 ml/kg。灌胃和腹腔注射的给药途径均能导致明显的肝纤维化,其中灌胃方式造模死亡率在10％以下,而腹腔注射方式造模死亡率在60％以上,说明灌胃造模动物耐受性较好。大鼠和小鼠应用CCl4后,血清 ALT均在第4周出现高峰,之后稍微下降,接着持续升高;血清HA则在第6周开始升高,至12周实验结束时仍在继续升高。造模12周时大鼠肝纤维化评分高于小鼠,说明大鼠模型的病理改变较小鼠模型更严重。以上结果提示大鼠和小鼠肝纤维化发生发展过程中各项指标的变化趋势类似,均可以用于抗肝纤维化药物的筛选和评价。　　二、HZGT疗效的观察　　通过第一部分的研究,确立了CCl4肝纤维化模型的造模方法为1ml/kg CCl4灌胃给药。在此基础上,观察了HZGT对小鼠模型的疗效。结果显示,肝纤维化小鼠体重的增长受到抑制,血清ALT和HA明显升高,肝纤维化病理评分为为2.7±1.2。HZGT对肝纤维化小鼠体重增长的抑制没有明显改善,能在造模第5周和第11周显著降低肝纤维化小鼠血清ALT,能在第12周显著降低其血清HA,减少肝纤维化小鼠肝脏的纤维化病理评分,以上结果说明HZGT对CCl4所致的小鼠肝纤维化具有明显的治疗作用。　　进而在大鼠模型上进一步观察了HZGT的疗效。结果显示,肝纤维化大鼠体重的增长受到明显的抑制,血清 ALT、HA和LN明显升高,肝纤维化评分为4.0±0.0。HZGT能够促进肝纤维化大鼠体重的增长,能在第8周和第10周显著降低其血清ALT,能在第10周显著降低其血清HA和LN,减少其肝脏胶原的沉积和组织病理评分,以上结果说明HZGT对CCl4所致大鼠肝纤维化具有明显的治疗作用。　　上述研究表明,HZGT对 CCl4所诱导的肝纤维化具有明显的治疗作用。由于我国的肝纤维化主要是由乙肝病毒引起的免疫性肝炎迁延不愈造成的,ConA诱导的急性肝损伤和病毒引起的爆发性肝炎有相似的特征。本研究进一步考察HZGT对ConA诱导的免疫性肝炎的作用。结果显示高剂量的HZGT能够显著地降低模型小鼠血清 ALT,提示 HZGT对免疫性肝炎具有保护作用。至于 HZGT对ConA诱导的免疫性肝纤维化模型是否有治疗作用,尚需进一步研究。　　三、HZGT作用机制的研究　　目前的研究表明,HSC处于肝纤维化的中心环节,是细胞外基质的主要产生细胞,TGF-b1是促进HSC产生胶原最强的细胞因子。　　因此本部分研究首先在整体动物模型上考察了HZGT对肝纤维化小鼠血清TGF-b1的作用。结果显示,HZGT能够剂量依赖性的降低肝纤维化小鼠血清中TGF-b1的含量。以上结果提示,HZGT可能能够影响HSC的增殖和胶原的产生。　　进而在细胞水平上考察了HZGT对肝星形细胞系LX-2细胞增殖、形态和凋亡的影响。结果显示,HZGT含药血清能够促进 LX-2细胞的生长,改变 LX-2细胞的形态,降低LX-2细胞的存活率,增加LX-2细胞的凋亡。以上结果提示TGF-b1→HSC通路是HZGT抗肝纤维化的途径之一。　　通过以上研究,本论文主要得到以下结论:　　1、通过对 CCl4造模剂量、造模途径及动物种属进行考察,确定 CCl4合适的造模剂量为1.0 ml/k,造模途径宜选灌胃方式,大鼠和小鼠模型肝纤维化的各项指标变化趋势一致,均可用于抗肝纤维化药物的筛选和评价。　　2、HZGT能降低肝纤维化小鼠血清 ALT、HA值及肝脏的胶原沉积和肝纤维化病理评分,说明 HZGT对 CCl4所致小鼠肝纤维化具有明显改善作用。　　3、HZGT能减轻CCl4所致肝纤维化大鼠体重的降低,并能降低肝纤维化大鼠血清ALT、HA和LN值及肝脏的胶原沉积和肝纤维化病理评分,说明对 CCl4所致大鼠肝纤维化具有明显改善作用。　　4、HZGT能降低ConA诱导的肝损伤模型小鼠血清ALT活力,提示HZGT对免疫性肝炎具有保护作用。　　5、HZGT能够剂量依赖性地降低肝纤维化小鼠血清 TGF-b1的含量,改变HSC的活化状态,降低 LX-2细胞的存活率,促进 HSC的凋亡,提示TGF-b1-HSC通路是HZGT抗肝纤维化的途径之一。