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杏(PrunusarmeniacaL.)是蔷薇科(Rosaceae)杏属(PrunusArmeniaca)的核果类果树。新疆杏种质资源丰富,有白色、黄色、橙色和红色等众多的色泽变异类型,是研究果实呈色机制的理想模式材料。花色素苷是由类黄酮代谢通路合成的一类水溶性类黄酮色素,广泛存在于植物中,其具有抗氧化、抗衰老、预防心血管疾病等多种功能。花色素苷的种类和含量决定了果实的呈色,调控花色素苷代谢途径的转录因子已在多种植物中报道,但目前对于杏果实中与花色素苷合成相关的转录因子尚不清楚。本研究以红色品种(“旦杏”、“红玉杏”)、浅色品种(“白杏”、“轮台小白杏”)和套袋处理的果实(“白杏”、“旦杏”)为材料,利用高效液相色谱(HPLC)技术鉴定果实发育过程中花色素苷的种类和含量变化。基于基因共表达网络分析(WGCNA)从杏果实转录组数据中挖掘与花色素苷合成相关转录因子,利用构建系统进化树和蛋白结构分析进行功能预测,在克隆基因全长的基础上,通过亚细胞定位、基因表达模式分析及其与花色素苷合成之间的关系,初步探讨MYB参与调控杏果实花色素苷的功能。主要研究结果如下: 1、供试品种中共检测到3种花色素苷,分别为矢车菊-3-O-芸香糖苷、花青素鼠李葡糖苷(矢车菊-3-O-芸香糖苷氯化物)、芍药-3-O-芸香糖苷。“旦杏”和“红玉杏”中总花色素苷含量分别为35.05mg/kg、39.17mg/kg,远高于“白杏”及“轮台小白杏”中的0.09mg/kg和0.07mg/kg。在红色品种中,花青素鼠李葡糖苷占据主导地位,分别占“旦杏”和“红玉杏”总花色素苷的58.8%和62.7%。浅色品种未检测到花青素鼠李葡糖苷的积累。“旦杏”的花色素苷积累模式为成熟期积累型,“红玉杏”为发育中期积累型。 2、使用基因共表达网络分析(WGCNA)和系统进化树分析从杏果实中挖掘出一个可能与花色素苷合成相关的转录因子Unigene1373。 3、利用3’RACE和5’RACE技术克隆其全长,得到一段675bp含有完整开放阅读框的基因序列,其编码225个氨基酸。蛋白质结构域分析表明,该序列编码一个R2R3-MYB转录因子,并且该转录因子与花色素苷的合成相关,所以,我们将Unigene1373命名为PaMYB10。 4、构建绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体p163-GFP-MYB10,以空载体p163-GFP为对照,基因枪法转化洋葱表皮细胞后,激光扫描共聚焦显微镜观察p163-GFP-MYB10蛋白的亚细胞定位情况,结果表明该基因定位于细胞核中。 5、利用qRT-PCR技术,分析PaMYB10和花色素苷合成相关结构基因在不同色泽品种各发育时期的表达量,结果表明红色品种各基因的相对表达量显著高于浅色品种(P<0.05)。“旦杏”的PaMYB10基因、CHI、CHS、LDOX、UFGT1、UFGT2在整个发育阶段一直呈上升趋势,其表达量与花色素苷的积累量呈显著的正相关关系。“红玉杏”的PaMYB10以及大部分结构基因的表达模式呈“双峰型”,并于绿熟期(S4)达到最高值,各个基因在“白杏”和“轮台小白杏”的幼果期(S1)—转色期(S3)少量表达,而在果实发育后期仅检测到有极少部分基因的表达,这一变化与花色素苷的含量相一致。 6、套袋影响果实的呈色,“白杏”套袋使果实L*从72.98降低到63.76,其亮度显著降低,色彩饱和度从-1.66降低到-2.43,套袋使“旦杏”果皮不能出现红色相色。HPLC分析发现,套袋果实的花色素苷含量大幅度降低,“旦杏”从35.05mg/kg降低到2.17mg/kg,“白杏”从0.04mg/kg降低为0.02mg/kg。qRT-PCR结果表明,PaMYB10以及与花色素苷合成相关基因的表达量也显著低于未套袋果实(P<0.05)。 综上所述,从杏果实中分离鉴定的PaMYB10转录因子参与了花色素苷代谢通路中杏果实中花色素苷的合成的调控,并影响果实相色的形成。