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目的:通过研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)的体外诱导扩增的改进方法、生物学特征及由转染过表达E2F-1的MGC-803细胞所制成的细胞抗原所引起的DCs介导的特异性CTL体外杀伤胃癌MGC-803细胞的作用,为DCs疫苗应用于临床治疗胃癌提供理论依据和可行性依据。方法:(1)胃癌MGC-803细胞株的培养扩增:选用具有高侵袭,高增殖特性的典型的胃癌细胞MGC-803,测定细胞倍增时间、生长曲线以确定实验细胞的培养天数。(2)过表达E2F-1的转染:将已经构建好的pCMV-E2F-1-HA真核表达载体以及空载体pCMV-HA用脂质体Lipofectamine 2000介导法瞬时转染至人胃癌细胞MGC-803里,两组细胞分别命名为MGC-803+空载体,MGC-803+E2F-1应用RT-PCR检测各组E2F-1基因的mRNA表达情况,Western blot检测各组E2F-1蛋白的表达情况。(3)树突状细胞(dendritic cells,DCs)体外培养及鉴定:用rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a和LPS培养健康人外周血单个核细胞,使之诱导成为DCs,通过形态学及免疫学方法对DCs进行鉴定。(4)过表达E2F-1的MGC-803细胞制成的抗原致敏DCs:在培养至第5天的DCs中分别加入过表达E2F-1的MGC-803细胞制成的抗原致敏DCs,培养24小时后加入rhTNF-α,以促进DCs成熟,并将成熟DCs与自体T淋巴细胞共同培养,同种淋巴细胞混合反应(T淋巴细胞增殖反应):DCs与T淋巴细胞共同培养72小时,在结束培养前2小时加入CCK-8,检测光密度(OD450)值,计算刺激指数(stimulation index, SI)。(5)IFN-γ含量检测:分别收集DCs与T淋巴细胞共同培养后第24小时、48小时和72小时的细胞培养上清液,ELISA法检测培养液中的IFN-γ的含量。(6)细胞毒T淋细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤MGC-803细胞能力检测:致敏DCs在48小时后与T淋巴细胞共同培养72小时,即可诱导为DC-CTL;然后将各组DC-CTL与胃癌MGC-803细胞株共同培养6小时,在结束培养前2小时采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测各组培养液中LDH的含量来明确杀伤效果。结果:(1)胃癌MGC-803细胞株: MGC-803细胞的生长曲线近似“S”形,在传代后的第一天细胞数有所减少,再经过1-2天的潜伏期,进入对数生长期,第4天达到生长的最高峰,故本课题的所有实验均取3~5天处于对数生长期的MGC-803细胞进行实验。(2)RT-PCR和Western blot实验结果显示在转染组MGC-803细胞中E2F-1在mRNA水平和蛋白质水平都有较强表达;(3)流式细胞仪检测经细胞因子联合诱导的DCs,其结果显示HLA-DR(91.72%)、CD86(92.78%)和CD83(80.14%)表达较高;而CD80(62.69%)、CD1a(33.91%)表达较低。(4)过表达E2F-1抗原致敏的DCs能促进T淋巴细胞的增殖,过表达E2F-1组T淋巴细胞SI值明显高于其他各组(P<0.05)。(5)不同组别致敏的DCs均能促进T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ,过表达E2F-1抗原组T淋巴细胞分泌IFN-γ的量明显高于其他各组(P<0.05)。(6)过表达E2F-1抗原致敏的DCs诱导的CTL对胃癌MGC-803细胞株的杀伤率明显高与其他各组(P<0.05),空载体组和单纯MGC-803组致敏的DCs诱导的CTL对胃癌MGC-803细胞株的杀伤率无差异(P>0.05);而空白对照组DC-CTL对MGC-803癌细胞株的杀伤率明显下降。结论:过表达E2F-1抗原致敏的DC在体外可诱导出高度特异性的抗肿瘤免疫应答,提示E2F-1基因可作为免疫治疗胃癌的靶点,负载过表达E2F-1抗原的DC疫苗在胃癌治疗中起重要作用。