心房颤动（atrial fibrillation，AF，房颤）是临床上最常见且危害严重的心律失常之一。国内调查房颤发病率为0.77％，50～59岁人群中为0.5％，80岁以上人群中上升至7.5％，男性略高于女性。房颤可引起患者心悸，诱发心力衰竭、心动过速性心肌病，还可引起动脉栓塞，以脑卒中危害最大。多数房颤继发于严重的器质性心脏病或存在危险因素，但也有15％～30％的房颤患者，发病年龄相对较轻，无明确病因，称作特发性房颤或孤立性房颤，与基因变异密切相关。早在1943年就有家族性房颤的相关报道。Darbar等发现914例AF患者中，36％是孤立性AF，其中家族性AF占15％（占所有AF的5％）。1997年Brugada等对6个呈常染色体显性遗传的房颤家系进行基因分析，将相关基因定位在染色体10q22～q24上，但具体致病基因不确定。2003年，Ellinor等对房颤家系的研究将致病基因定位在染色体6q14～q16上，提示房颤是遗传异质性疾病。2003年，我国学者陈义汉等首次报告了中国一房颤家系KCNQ1基因S140G突变，功能研究显示S140G突变对KCNQ1／KCNEl和KCNQ1／KCNE2电流产生了功能增强效应（gain-of-function），可能由此缩短动作电位和有效不应期，引发房颤。随后，更多的房颤致病基因和遗传易感基因被确定，其中以心肌细胞离子通道基因与房颤的关系最为密切。缓慢型延迟整流钾电流(I_Ks)与快速型延迟整流钾电流(I_Kr)是心肌细胞复极的主要电流，已经明确其功能增强可使复极加快，动作电位和有效不应期缩短，而利于房颤的发生和维持。心肌细胞电压依赖性钾离子通道由α亚基和β亚基共同组成，β亚基作为α亚基的辅助亚单位，调节其门控动力学特性，影响通道蛋白的转运、修饰和细胞膜定位。KCNE基因家族编码一类钾离子通道β亚基，与KCNQ1、HERG、Kv3.4、Kv2.1及HCN等多种离子通道相互作用，发挥重要的生理功能。目前有5个家族成员，依次命名为KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNE4和KENE5，分别编码蛋白MinK和MiRP1～4（MinK相关多肽1～4）。2002年，台湾学者发现KCNE1基因38G等位基因在有房颤危险因素的患者中易引起房颤。2004年，陈义汉研究组Yang等在家族性房颤患者中发现了KCNE2基因突变R27C，对KCNQ1／KCNE2电流产生功能增强效应，但对I_Kr电流没有影响，也没有改变HCN通道的功能。2005年，我国学者又在家族性房颤家系中找到了KCNE3基因R53H突变，位于KCNE3的跨膜段，是一个保守碱基，提示KCNE3基因可能与房颤相关。功能研究发现KCNE4和KCNE5是KCNQ1通道的抑制性亚单位，本研究室滕思勇等于2002年克隆了人类KCNE4基因。2005年，Ravn等对KCNE5基因T97C多态性与房颤的关系进行了研究，发现97T等位基因在对照组（96例）的频率显著高于房颤组（158例），提示T等位基因可能是AF的抑制性基因。分子遗传学研究发现，除了家族性房颤外，人群中散发的房颤患者存在一定的遗传易感性。目前，对于房颤易感基因的研究已成为群体遗传学的重要内容。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是人类基因组DNA序列变异的主要形式，是决定人类疾病（尤其是多基因疾病）易感性和药物反应性差异的核心信息，作为第三代遗传标记在遗传性疾病特别是多基因遗传病等研究方面日益受到重视。2004年，本研究室曾志宇等对I_Ks通道基因单核苷酸多态性与房颤的关系做了系统的研究。其中KCNE1（G38S）是一个广泛存在的SNP，频率较高，既往台湾学者研究认为38G等位基因与房颤有关，但曾治宇等的研究与此结果不同，未证实KCNE1（G38S）与房颤相关；而国内一项研究，入选94例孤立性房和130例对照，亦未发现KCNE1（G38S）与房颤有关。因此，KCNE1（G38S）是否与房颤相关受到很大的质疑。此外，曾治宇等首次报道了中国汉族人群KCNE4基因的SNP位点。共发现8个SNP，外显子处3个，1个非同义SNP，即KCNE4（E145D）。对其进行病例对照研究，χ²分析显示KCNE4（E145D）多态性在房颤组和对照组间的分布无显著差异，进一步Logistic回归分析提示KCNE4（145D）与房颤有关（P=0.044，OR=1.66），但曾等没有对该基因多态性在另设人群中扩大样本进一步验证，也没有进行深入的功能研究。早期Ackerman等和Iwasa等在亚洲人群中对KCNE2进行了SNP研究，未发现多态性位点，迄今没有在亚洲人群中筛查KCNE3和KCNE5 SNP的相关报道，而在欧洲人和非裔美国人中，已有较多的SNP位点被筛查出，并进行了电生理学和药理学研究。由此可见，有必要对KCNE基因家族单核苷酸多态性进行系统研究。当今，国内外探讨SNP与疾病的相关性，一方面是对一组人群中发现的疾病相关SNP在另一组人群中进行验证；另一方面是对疾病相关的SNP进行功能研究。在体外异源表达系统上转基因表达通道蛋白，采用全细胞膜片钳技术记录通道电流，分析通道的动力学特征，从而探讨基因变异引起的细胞电生理学变化，是目前对离子通道基因疾病相关变异进行功能研究的重要手段。KCNE基因家族作为钾离子通道α亚基的辅助亚单位，有重要的生理功能，不同的KCNE成员对I_Ks和I_Kr电流有各自不同的影响，而I_Ks和I_Kr电流作为心肌细胞复极化的主要电流，与心律失常的发生密切相关。因此，KCNE家族成员的基因变异可能会引起I_Ks和I_Kr电流密度或通道动力学特征改变，影响动作电位时程和有效不应期，从而触发或抑制房颤的发生。目的本研究在中国汉族人群中扩大样本研究KCNE基因家族SNP与房颤的相关性。针对房颤相关的KCNE基因SNP进行深入的功能研究，探讨它们对KCNQ1和HERG通道的功能影响。同时，使用抗心律失常药物进行急性干预，分析基因多态性对药物短期电生理效应的影响，从而为房颤个体的遗传易感性和药物反应性差异提供分子遗传学基础。第一部分：1．鉴于目前国内外关于KCNE1（G38S）与房颤相关性的研究，结果存在争议，本研究拟扩大样本量，在中国人群中再次验证KCNE1（G38S）与房颤的相关性。2．KCNE4对KCNQ1通道有重要的调节作用，而KCNQ1电流与房颤的发生密切相关，本研究拟扩大样本量进一步验证KCNE4（E145D）与房颤的相关性。3．本研究拟在中国汉族人群中筛查KCNE家族其它成员KCNE2、KCNE3和KCNE5基因多态性，对各基因外显子编码区进行测序分析，试图找到SNP位点，并进行房颤相关的病例对照研究。第二部分：本部分研究拟在以上实验结果的基础上，对发现的与房颤相关的基因单核苷酸多态性（如KCNE4（E145D））进行深入的功能研究。构建含多态性位点的真核系统表达载体，转基因表达钾离子通道蛋白KCNQ1和HERG，共表达KCNE亚单位及其SNP，利用全细胞膜片钳技术和细胞免疫荧光技术进行细胞电流记录和蛋白定位，从而深入分析基因变异前后对通道的功能影响，探讨房颤发生和维持的分子机制。在此基础上，使用Ⅲ类抗心律失常药物胺碘酮进行急性干预，分析基因多态性对胺碘酮短期电生理学效应的影响，探讨SNP与个体药物反应性的关系。方法第一部分：研究入选320例房颤患者和404例正常对照，肘静脉采血5ml，酚-氯仿方法提取基因组DNA。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增含KCNE1（G38S）和KCNE4（E145D）位点的目的片段，采用限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法鉴定SNP基因型，进行病例对照研究，统计分析采用SPSS10.0软件。计量资料用均数±标准差表示，2组比较，采用student t检验。计数资料采用χ²检验。P＜0.05认为有统计学意义。从房颤组和对照组中各随机选取24例样本，总计48例，对KCNE2基因2号外显子序列和KCNE3基因3号外显子序列进行PCR扩增，测序。随机选取24例女性样本和48例男性样本（共96条X染色体），进行KCNE5基因外显子序列扩增测序。第二部分：利用大肠杆菌重组质粒扩增法扩增真核表达质粒，采用重叠延长PCR方法进行体外构建基因多态性位点。然后，用Qiagen质粒大提试剂盒（EndoFree Plasmid Purification）进行提取纯化。培养CHO-K1和HEK293细胞，脂质体瞬时转染方法进行基因转染，采用全细胞膜片钳方法记录细胞电流及细胞免疫荧光法进行蛋白细胞定位。同时，配制一定浓度的抗心律失常药胺碘酮，进行细胞外灌流，分析药物急性干预前后细胞KCNQ1和HERG电流的变化，探讨SNP是否影响药物的细胞电生理学作用。数据的采集和分析使用Clamfit10.0软件进行。结果第一部分：房颤组共320例患者，男性233例（72.8％），年龄52.40±16.18岁。其中特发性房颤140例（45.3％），器质性房颤180例（54.7％）；主要危险因素：高血压35.9％、冠心病7.5％、糖尿病10.9％。对照组404例，为健康体检人群，男性283例（70.0％），年龄53.33±15.17岁，在高血压、冠心病、糖尿病以及吸烟饮酒等因素上与房颤组匹配较好。两组均为中国汉族人群，且均排除病态窦房结综合征及预激综合征患者。χ²分析未发现KCNE1（G38S）与房颤相关。在房颤组与对照组中，KCNE4基因SNP位点D型等位基因频率分别是28.6％和21.4％（P=0.005），杂合子ED频率为49.7％和40.6％，χ²分析结果显示KCNE4（E145D）与房颤相关，KCNE4基因D型等位基因是房颤的危险因素。第二部分：全细胞膜片钳电生理研究发现KCNE4亚单位抑制了KCNQ1电流。单独表达KCNQ1通道的细胞，在膜电位+60mV时，平均电流密度为24±2.9pA／pF，当KCNQ1和KCNE4共表达时，细胞电流密度降至7.3±1.1pA／pF（n=10）。而KCNE4（145D）与KCNQ1共表达后，不仅失去了KCNE4对KCNQ1的抑制作用，反而增加了KCNQ1电流，在膜电位+60mV时电流密度增至42.9±3.7pA／pF（n=12），几乎是KCNQ1单独表达时的2倍，且引起通道动力学特征发生改变。细胞免疫荧光蛋白定位研究显示SNP对KCNE4亚单位自身的蛋白定位无影响，KCNQ1与KCNE4（145E）或KCNE4（145D）共表达时，KCNQ1在细胞膜上的定位也没有受到影响，这排除了KCNE4基因多态性对KCNQ1电流的作用效应是由于影响KCNQ1蛋白表达的可能。共转染HERG+KCNE4（145E）和HERG+KCNE4（145D），结果均没有增大或减小HERG电流，也没有改变通道的动力学特性，KCNE4（145E／D）对HERG电流无影响。药物研究发现，细胞外灌流胺碘酮（10μM），对细胞KCNQ1电流有轻度的抑制作用，抑制率为7.8±1.2％；同样浓度的胺碘酮对HERG电流有明显的抑制作用，抑制率为35.8±4.5％。共表达KCNE4（145D），对胺碘酮抑制KCNQ1和HERG电流的这种急性细胞效应没有影响。结论本研究对KCNE基因家族单核苷酸多态性与房颤的相关性进行了系统的研究，对房颤相关的KCNE4（E145D）的细胞电生理功能进行了深入的探讨，为证实KCNE4（E145D）与房颤的相关性提供了有利证据。同时，进一步研究了这一多态性对抗心律失常药物胺碘酮的短期电生理效应的影响，探讨了KCNE4（E145D）与人群的房颤易感性和药物反应性之间可能存在的关系。1、通过大样本病例对照研究，对KCNE1（G38S）和KCNE4（E145D）与房颤的相关性问题进行了验证，排除了KCNE1（G38S）与房颤相关，证实了KCNE4（E145D）与房颤显著相关，KCNE4基因D型等位基因是房颤的危险因素。2、在本研究人群中，不存在KCNE2、KCNE3和KCNE5基因的SNP位点。3、KCNE4（E145D）多态性对KCNQl通道产生功能增强效应（gain of function），增加了KCNQ1电流，改变了通道动力学特征，这种作用有可能缩短动作电位时程和有效不应期，从而有利于房颤的发生与维持。蛋白的免疫荧光细胞定位排除了KCNE4（145E／D）对KCNQ1蛋白的细胞膜表达产生影响的可能，提示该SNP并不影响KCNQ1蛋白的合成和转运。4、KCNE4（145E／D）对HERG通道没有产生任何功能影响，提示该SNP不是通过影响I_Kr电流宋实现致房颤作用的。5、胺碘酮对HERG电流的抑制比对KCNQ1电流的抑制更强，KCNE4（145D）基因多态性对胺碘酮的这种短期电生理效应没有影响，不支持该多态性能影响个体对药物的反应性。6、KCNE4（E145D）对心肌细胞动作电位以及心肌整体水平的电生理特征有何影响有待进一步的研究。