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邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）是目前消费量最高的一种增塑剂,用于儿童玩具、食品包装、医疗器械等塑料制品。DEHP与塑料主体以非共价键结合,容易脱离主体进入环境,通过饮食、呼吸等途径进入机体,并在数小时内被分解为邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（mono-（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP）。DEHP是一种环境内分泌干扰物,可对机体产生生殖毒性、发育毒性、肝脏毒性等毒性作用。近年来有研究表明DEHP具有甲状腺毒性,影响甲状腺的正常功能,但毒作用机制尚不清楚。雌激素受体（estrogen receptors,ERs）在甲状腺疾病发生发展中发挥重要作用,DEHP作为一种环境类雌激素,可以影响机体ERs表达,激活细胞内质网应激,提示ERs激活内质网应激可能在DEHP的甲状腺毒性中发挥作用。本研究通过给予人甲状腺滤泡上皮细胞（Nthy-ori 3-1细胞）MEHP染毒,明确MEHP对Nthy-ori 3-1细胞的毒性作用、对ERs表达及对细胞内质网应激的影响;通过抑制细胞内质网应激,检测细胞毒性的变化,明确内质网应激在MEHP甲状腺毒性中的作用;再通过抑制细胞ERs基因表达,检测基因抑制后细胞内质网应激和细胞毒性的变化,明确ERs对内质网应激的调控作用及其在MEHP甲状腺毒性中的作用机制,为防治DEHP所致甲状腺疾病提供科学依据。第一部分MEHP对Nthy-ori 3-1细胞的毒性作用及对ERs表达的影响目的:明确MEHP对Nthy-ori 3-1细胞的损伤作用以及对细胞甲状腺激素分泌功能的影响;明确MEHP对细胞ERs表达的影响。方法:采用含10%FBS的RPMI 1640培养基体外培养Nthy-ori 3-1细胞,并给予不同浓度MEHP染毒24h,采用CCK-8法检测细胞存活率,确定MEHP染毒剂量。实验分组为对照组（Con）、溶剂对照组（VCon）、MEHP染毒组（5μM、25μM、125μM MEHP）。采用PI染色法检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡,DCFH-DA染色法检测细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）水平。在细胞培养基中添加2m IU/L促甲状腺激素并给与相应浓度的MEHP染毒,采用ELISA法检测游离三碘甲状腺原氨酸（free Triiodothyronine,FT3）、游离甲状腺素（free thyroxine,FT4）水平。采用Real-Time PCR和Western Blot法检测甲状腺激素合成相关基因和ERs mRNA及蛋白表达水平。各检测指标结果以（?）±s表示,使用IBM SPSS 24.0软件进行统计分析,采用单因素方差分析比较多组间各检测指标的差异,组间两两比较采用LSD检验,检验水准为α=0.05。结果:1.随着MEHP染毒剂量增加,细胞形态逐渐由细长形变为圆形,且细胞之间管腔样连接减少。2.随MEHP染毒剂量增加,细胞凋亡率和ROS水平显著升高（P＜0.05）,MMP水平显著降低（P＜0.05）。3.MEHP染毒组细胞培养液上清中FT3、FT4水平显著降低（P＜0.05）,125μM染毒组FT3、FT4水平显著低于5μM染毒组（P＜0.05）。4.MEHP染毒组细胞甲状腺激素合成相关基因TG、TPO、TSHR、NIS、PAX8、TTF1 mRNA水平均显著降低（P＜0.05）,125μM染毒组细胞TPO、TSHR、NIS、PAX8基因mRNA水平显著低于5μM染毒组（P＜0.05）。各染毒组细胞TG、TPO、NIS、PAX8、TTF1蛋白水平均显著降低（P＜0.05）,125μM染毒组细胞TG、TSHR蛋白水平显著低于5μM染毒组（P＜0.05）。5.MEHP染毒组细胞雌激素受体基因ERα、GPR30 mRNA和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,125μM染毒组的表达水平显著高于其它各组（P＜0.05）。结论:1.MEHP暴露可导致Nthy-ori 3-1细胞凋亡,ROS水平升高,MMP水平降低,对细胞产生损伤作用。2.MEHP暴露可降低Nthy-ori 3-1细胞甲状腺激素合成相关基因mRNA和蛋白表达水平,导致FT3和FT4水平降低,影响细胞的正常功能。3.MEHP暴露可显著上调Nthy-ori 3-1细胞ERα和GPR30表达水平。第二部分MEHP对Nthy-ori 3-1细胞内质网应激的影响及其在细胞毒性中的作用目的:明确MEHP暴露对细胞内质网应激的影响,阐明内质网应激在MEHP造成Nthy-ori 3-1细胞损伤和细胞功能异常中的作用。方法:MEHP对细胞内质网应激影响的实验分组同第一部分。使用Fluo-4 AM荧光探针检测细胞Ca2+水平,采用Real-Time PCR和Western Blot法检测内质网应激相关信号通路基因mRNA及蛋白表达水平。使用4-PBA抑制细胞内质网应激,采用CCK-8法确定4-PBA的剂量,根据预实验确定4-PBA作用时间;采用Western Blot法检测抑制后内质网应激标志蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1α表达水平,确定4-PBA抑制效率。实验分组设定为对照组（Con）、溶剂对照组（VCon）、内质网应激抑制组（4-PBA）、125μM MEHP染毒组（MEHP）、125μM MEHP染毒+内质网应激抑制组（MEHP+4-PBA）。细胞凋亡率、ROS水平、MMP水平、培养液上清中FT3和FT4水平、甲状腺激素合成相关蛋白表达水平检测方法同第一部分。结果:1.随着MEHP染毒剂量的增加,细胞内Ca2+水平升高。2.25μM和125μM染毒组细胞内质网伴侣蛋白GRP78表达水平显著高于其它各组（P＜0.05）。3.MEHP暴露可激活细胞PERK-e IF2α-ATF4-CHOP信号通路。各染毒组细胞PERK、p-PERK、p-e IF2α蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）,125μM染毒组细胞PERK、p-PERK、p-e IF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平最高。4.MEHP暴露可激活细胞IRE1α信号通路和ATF6信号通路。125μM染毒组细胞IRE1α、p-IRE1α、p-JNK和ATF6 p50蛋白及XBP1s/XBP1u基因mRNA表达水平显著高于Con组和VCon组（P＜0.05）。5.使用2m M 4-PBA预处理细胞6h后再与MEHP共同作用于细胞24h,MEHP+4-PBA组细胞GRP78、p-PERK、p-IRE1α蛋白表达水平显著低于MEHP染毒组（P＜0.05）。6.细胞内质网应激被抑制的4-PBA组细胞凋亡率和ROS水平显著低于VCon组（P＜0.05）,MMP水平显著高于Con组和VCon组（P＜0.05）;MEHP+4-PBA组细胞凋亡率和ROS水平显著低于MEHP染毒组（P＜0.05）,MMP水平显著高于MEHP染毒组（P＜0.05）。7.MEHP+4-PBA组细胞培养液上清中FT3、FT4水平显著高于MEHP组（P＜0.05）,细胞甲状腺激素合成相关蛋白TG、TPO、NIS和PAX8表达水平显著高于MEHP组（P＜0.05）。结论:1.MEHP暴露可引起细胞内Ca2+水平升高,导致Ca2+稳态失衡,引起细胞内质网应激,导致内质网伴侣蛋白GRP78表达增加,激活未折叠蛋白反应信号通路PERK、IRE1α、ATF6通路。2.MEHP可通过激活细胞内质网应激降低Nthy-ori 3-1细胞MMP水平、增加细胞ROS水平和凋亡率,对细胞产生损伤作用。3.MEHP可通过激活内质网应激降低细胞甲状腺激素合成相关蛋白TG、TPO、NIS和PAX8表达水平,导致FT3和FT4水平降低,影响Nthy-ori 3-1细胞正常功能。第三部分ERs激活内质网应激在MEHP对Nthy-ori 3-1细胞毒性中的作用机制目的:明确雌激素受体ERα和GPR30在MEHP激活细胞内质网应激中的作用,阐明ERα和GPR30激活细胞内质网应激在MEHP对Nthy-ori 3-1细胞毒性中的作用机制。方法:使用转染试剂将siERα、siGPR30转染入细胞,采用Real-Time PCR和Western Blot法检测siERα和siGPR30的抑制效率。实验分组设定为对照组（Con）、阴性对照组（siNC）、基因抑制组（siERα或siGPR30）、125μM MEHP染毒组（MEHP）、125μM MEHP染毒+基因抑制组（MEHP+siERα或MEHP+siGPR30）。细胞内质网应激相关指标和细胞毒性相关指标的检测方法同前两部分。结果:1.siERα组细胞ERα基因mRNA及蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,mRNA抑制效率为83%;siGPR30组细胞GPR30基因mRNA及蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,mRNA抑制效率为65%。2.MEHP+siERα组和MEHP+siGPR30组细胞Ca2+水平、GRP78蛋白表达水平显著低于MEHP染毒组（P＜0.05）。MEHP+siERα组细胞p-PERK、p-e IF2α、ATF4、CHOP和ATF6 p50蛋白表达水平均显著低于MEHP染毒组（P＜0.05）,IRE1α和p-IRE1α蛋白表达水平与MEHP染毒组无明显差异（P＞0.05）。MEHP+siGPR30组细胞p-PERK、p-e IF2α、IRE1α、p-IRE1α和p-JNK蛋白表达水平均显著低于MEHP染毒组（P＜0.05）,ATF6 p50蛋白表达水平与MEHP染毒组无明显差异（P＞0.05）。3.MEHP+siERα组细胞凋亡率显著低于MEHP染毒组（P＜0.05）。MEHP+siGPR30组细胞ROS水平显著低于MEHP染毒组（P＜0.05）;MEHP+siGPR30组细胞MMP水平显著高于MEHP染毒组（P＜0.05）。4.MEHP+siERα组、MEHP+siGPR30组细胞培养液上清中FT3水平显著高于MEHP染毒组（P＜0.05）。MEHP+siERα组细胞TG、TPO、TSHR、NIS、PAX8、TTF1蛋白表达水平显著高于MEHP染毒组（P＜0.05）。MEHP+siGPR30组细胞TG、NIS、PAX8蛋白表达水平显著高于MEHP染毒组（P＜0.05）。结论:1.MEHP可通过上调ERα表达激活细胞内质网应激,并可激活PERK信号通路和ATF6信号通路介导的未折叠蛋白反应。2.MEHP可通过上调GPR30表达激活细胞内质网应激,并可激活PERK信号通路和IRE1α信号通路介导的未折叠蛋白反应。3.MEHP可通过上调ERα表达引起细胞凋亡,并可通过ERα降低甲状腺激素合成相关蛋白TG、TPO、TSHR、NIS、PAX8和TTF1的表达影响细胞FT3、FT4的分泌。4.MEHP可通过上调GPR30表达影响细胞ROS水平和MMP水平引起细胞损伤,并可通过GPR30下调甲状腺激素合成相关蛋白TG、NIS和PAX8的表达引起细胞FT3分泌障碍。5.ERs通过激活细胞内质网应激在MEHP对Nthy-ori 3-1细胞毒性中发挥重要作用。