目的：采用Illumina Solexa 高通量测序技术，分析自发性乳腺肿瘤C3H/HeJNju小鼠原发乳腺肿瘤组织与脾脏间CD4+CD25+Treg TCRβCDR3组库的同质性与异质性，探讨肿瘤组织与和全身免疫循环之间CD4+CD25+Treg的区别和联系，为进一步研究乳腺癌中Treg的机制与应用提供基础。　　方法：　　1. 10月龄以上的自发性乳腺肿瘤模型C3H/HeJNju出瘤小鼠3只，分别标记为M1、M2、M3。　　2. 分别采集M1、M2、M3小鼠原发乳腺肿瘤组织（T）和脾脏（S），采用磁珠分选技术分选出各组织CD4+CD25+Treg细胞，FCM鉴定纯度。　　3. 提取各分选获得的CD4+CD25+Treg细胞基因组DNA，样本序号命名：M1T：M1小鼠乳腺肿瘤组织样本；M1S：M1小鼠脾脏样本；　　M2T：M2小鼠乳腺肿瘤组织样本；M2S：M2小鼠脾脏样本；　　M3T：M3小鼠乳腺肿瘤组织样本；M3S：M3小鼠脾脏样本。　　4. 基因组DNA样本送Adaptive Biotechnologies Immuno SEQ公司（美国华盛顿医学院），经检测符合建库要求后，按小鼠TCRβCDR3组库制备技术建立每个样本CDR3组库，并采用高通量Illumina技术对各样本TCR CDR3进行测序。　　5. 从美国 Immuno SEQ公司测序原始数据库，下载每个样本原始序列(https://clients. adaptivebiotech.com)，6个样本原始序列名称分别为：DFFM1T-Treg、DFFM1S-Treg、DFFM2T-Treg、DFFM2S-Treg、DFFM3T-Treg、DFFM3S-Treg。采用Immuno SEQ 和IMGT/High V-QUEST 系统（http://www.imgt.org）等分析3只实验小鼠乳腺肿瘤组织与脾脏样本中CD4+CD25+Treg TCRβCDR3 组库序列的组成和特征：（1）引用反辛普森指数（The inverse Simpsons diversity index，1/DS）分析CDR3多样性；（2）CDR3组库高频（大于0.8%）、中频（0.4-0.8%）、低频(小于0.4%)克隆增殖比例的分布；CDR3 组库前20条高频增殖序列的组成和特征；（3）CDR3组库中TRBV和TRBJ基因家族的取用和配对；（4）CDR3组库中CDR3区的长度和氨基酸取用；（5）采用venn diagram软件分析CDR3组库中独特氨基酸重叠序列的数目和比例。　　结果：　　1．筛选出的自发性乳腺肿瘤模型C3H/HeJNju小鼠观察到肿瘤生长的现象，原发肿瘤组织经过病理HE染色结果鉴定证实为乳腺癌（南京大学-南京生物医药研究院）， 3只实验小鼠为不同类型乳腺癌，M1小鼠考虑为浸润性乳腺癌伴髓样特征；M2小鼠考虑乳腺纤维腺癌；M3小鼠考虑为乳腺乳头状癌。　　2．3只实验小鼠乳腺肿瘤组织与脾脏经磁珠分选技术分选得到的CD4+CD25+Treg细胞经FCM鉴定，纯度均达到80%以上，提取各样本总DNA，在0.7%琼脂糖凝胶电泳图DNA预测位置均出现清晰的条带。　　3. 六个样本CD4+CD25+Treg TCRβCDR3序列中总有效序列/独特序列 (Productive CDR3/Unique CDR3)数目比值：　　M1T：488/239； M1S：29568/9232；　　M2T：5173/2597； M2S：33963/14429；　　M3T：1545/347； M3S：37227/14338。　　4. 六个样本CD4+CD25+Treg TCRβCDR3的克隆扩增情况：　　（1）各实验样本反辛普森指数（1/DS）分别为：　　M1T：120.27；M1S：841.58；　　M2T：144.63；M2S：1269.92；　　M3T：69.08； M3S：553.35。　　（2）各实验小鼠总体上乳腺肿瘤组织的中频（0.8-0.4%）、高频（>0.8%）序列所占的比例较脾脏高，肿瘤组织的中高频增殖克隆序列较多，相反，脾脏的低频(<0.4%)序列所占的比例较肿瘤组织高，以低频增殖克隆为主。　　（3）高频克隆扩增前20条序列分析，同一只小鼠乳腺肿瘤组织与脾脏之间均存在3条以上完全相同的CDR3序列：　　M1 小鼠乳腺肿瘤组织与脾脏相同的 CDR3 序列总共有 3 条，分别为CASSQDRVGNTLYF、CASVDWGTLYF 和CASGPQGSAETLYF；　　M2 小鼠乳腺肿瘤组织与脾脏相同的 CDR3 序列总共有 6 条，分别为CASSHGLGGYAEQFF 、 CASSIPGYSYEQYF 、 CASSPGTDNQAPLF 、CASNPQGWGSDYTF、CASTWGEDEQFF和CASSRDGKSSYEQYF；　　M3 小鼠乳腺肿瘤组织与脾脏相同的 CDR3 序列总共有 3 条，分别为CASSQDWIEQYF、CASSDAGGAGDTQYF和CASSGWTGEQAPLF。　　5. 六个样本CD4+CD25+Treg TCRβCDR3组库TRBV、TRBJ基因家族取用和配对频率：　　（1）M1、M2、M3小鼠乳腺肿瘤组织及脾脏前五个优势取用的TRBV基因家族中相同的包括：TRBV19-1。　　（2）M1、M2、M3小鼠乳腺肿瘤组织及脾脏前五个优势取用的TRBJ基因家族中相同的包括：TRBJ1-3、TRBJ2-1、TRBJ2-7。　　（3）M1、M2、M3小鼠在乳腺肿瘤组织与脾脏间存在共同的TRBV-TRBJ基因家族优势配对（>2%）参与有效的基因重排，分别为TRBV05-01-TRBJ02-07；TRBV19-01-TRBJ02-07。不同小鼠的肿瘤组织出现>3%的TRBV-TRBJ基因优势配对，而在脾脏中低频表达，各乳腺肿瘤组织优势配对包括：　　M1 小鼠乳腺肿瘤组织优势配对 TRBV13-03 -TRBJ01-03(6.15%)、TRBV13-02-TRBJ02-04 (3.69%)、TRBV13-03-TRBJ02-05(3.69%)；　　M2 小鼠乳腺肿瘤组织优势配对 TRBV02-01 - TRBJ02-01(8.77%)、TRBV19-01-TRBJ01-03 (3.39%)；　　M3 小鼠乳腺肿瘤组织优势配对 TRBV13-02-TRBJ02-02(4.47%)、TRBV01-01-TRBJ01-03（4.4%）、TRBV17-01-TRBJ01-05(3.56%)。　　（4）乳腺肿瘤组织与脾脏间TRBV-TRBJ基因家族配对经统计分析，有多组配对具有统计学意义（*P<0.05 ） ，包括：TRBV03-01-TRBJ 01-02、TRBV03-01-TRBJ01-06、TRBV13-01-TRBJ01-01、TRBV16-01-TRBJ01-03、TRBV16-01-TRBJ02-04、TRBV19-01-TRBJ02-05、TRBV21-01-TRBJ02-01、TRBV21-01-TRBJ02-05、TRBV21-01-TRBJ02-07、TRBV22-01-TRBJ01-06、TRBV22-01-TRBJ02-03、TRBV22-01-TRBJ02-04、TRBV22-01-TRBJ02-07、TRBV23-01-TRBJ02-07、TRBV24-01-TRBJ02-01、TRBV24-01-TRBJ02-03、TRBV29-01-TRBJ01-06、TRBV31-01-TRBJ01-03。　　6. 六个样本CD4+CD25+Treg TCRβCDR3 AA取用和长度分布：　　（1）M1、M2、M3小鼠乳腺肿瘤组织及脾脏样本CD4+CD25+Treg TCRβCDR3 AA高频取用均以丝氨酸（S）为主。　　（2）M1、M2、M3小鼠乳腺肿瘤组织及脾脏样本CD4+CD25+Treg TCRβCDR3 AA长度分布，均是以12个氨基酸长度为主的钟形分布。　　7. 六个样本CD4+CD25+Treg TCRβCDR3组库克隆重叠率：　　M1T﹠M1S=37.24%； M1S﹠M1T=0.96%；　　M2T﹠M2S=35.7% ； M2S﹠M2T=6.43%；　　M3T﹠M3S=68.01%； M3S﹠M3T=1.65%。　　8. 六个样本CD4+CD25+Treg TCRβCDR3组库独特氨基酸重叠序列　　（1）M1、M2、M3小鼠各自的乳腺肿瘤组织及脾脏样本CD4+CD25+Treg TCRβCDR3独特的氨基酸重叠序列分别为89条、927条、236条。3只小鼠乳腺肿瘤组织之间重叠的氨基酸序列极少，脾脏组织之间存在多条相同的氨基酸重叠序列：　　M1与M2小鼠乳腺肿瘤组织之间有1条氨基酸重叠序列；　　M2与M3小鼠乳腺肿瘤组织之间有4条氨基酸重叠序列；　　M1与M3小鼠乳腺肿瘤组织之间没有氨基酸重叠序列；　　M1与M2小鼠脾脏之间有535条氨基酸重叠序列；　　M1与M3小鼠脾脏之间有531条氨基酸重叠序列；　　M2与M3小鼠脾脏之间有726条氨基酸重叠序列。　　（2）M1、M2、M3小鼠乳腺肿瘤组织与脾脏间独特的氨基酸重叠序列中，在乳腺肿瘤组织中高频表达的前20条CDR3序列在脾脏中大多数低频表达。　　结论：　　1. 自发性乳腺肿瘤小鼠肿瘤组织中可能存在较多高频克隆增殖的Treg细胞，其可能在肿瘤组织中抑制效应T细胞的抗肿瘤免疫应答，从而促进肿瘤的生长和转移。　　2. 自发性乳腺肿瘤小鼠肿瘤组织中的TRBV-TRBJ基因优势配对与脾脏之间存在差异，以及重叠CDR3序列的数目和特征，提示肿瘤局部与循环免疫系统存在差异性的Treg细胞，为进一步探讨肿瘤微环境中Treg细胞的来源、特征和功能研究提供基础。