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萜类作为自然界中种类最多的一类天然产物,在植物生长发育、防御响应、化工生产、医药开发等方面起着重要作用。萜类植保素是以萜烯为骨架经多步修饰形成的,具有广谱抗菌性,在玉米、水稻等作物的抗逆响应中起着重要作用。稻瘟病是水稻生产中的重要病害,严重影响水稻的产量和品质。而稻瘟病的侵染会导致水稻中由ent-casbene衍生而来的二萜植保素ent-10-oxodepressin的积累,其对稻瘟病菌的孢子萌发和生长具有明显的抑制作用,但其生物合成途径还不清晰。本研究通过大肠杆菌代谢工程、NMR分析、水稻转基因株系构建等手段,成功解析了水稻生物合成基因簇c7BGC参与水稻二萜植保素ent-10-oxodepressin的生物合成途径,即OsECBS催化GGPP生成ent-casbene后,经Os CYP71Z21/22在C10位上进行连续催化后形成ent-10-keto-casbene,然后经Os CYP71Z2在C5位上氧化形成ent-10-oxodepressin,这为其转录调控和水稻抗性育种等提供靶基因。主要的研究结果如下:1.基于ent-10-oxodepressin的母核结构为ent-casbene,使用已报道的蓖麻Rc CBS（Ricinus communis casbene synthase）序列在水稻基因组数据库中进行同源检索,筛选得到OsTPS28作为水稻CBS候选基因。使用大肠杆菌代谢工程、NMR分析、比旋光度测定等鉴定OsTPS28催化GGPP的主产物为ent-casbene。因此将OsTPS28命名为OsECBS（Oryza sativa ent-casbene synthase）。2.多种萜类植保素的生物合成相关基因在染色体上以基因簇形式存在。分析OsECBS所在的水稻7号染色体位置附近基因信息,发现在长为141k B的区段内含有4个CYP基因（Os CYP71Z2/21/22/30）。利用Rice XPro转录组相关数据和q RT-PCR分析,分析了各基因在水稻不同发育时期、组织和处理下的基因表达模式。结果表明,Os CYP71Z30无表达;其余四个基因表达模式相似。故将该区段命名为c7BGC。3.将OsECBS与单个CYP进行组合共表达并鉴定产物。结果表明,Os CYP71Z30不能催化OsECBS产物;Os CYP71Z2可在ent-casbene的C5位上进行连续氧化,形成5S-hydroxy-ent-casbene和ent-5-keto-casbene;Os CYP71Z21/22可在ent-casbene的C10位上进行连续氧化,产生10S-hydroxy-ent-casbene和ent-10-keto-casbene。4.将ent-5-keto-casbene和ent-10-keto-casbene分别饲喂到含单个CYP的发酵菌中,鉴定其产物组成。结果表明Os CYP71Z2可在ent-10-keto-casbene的C5位上进行连续催化形成ent-10-oxodepressin;而Os CYP71Z21/22可在ent-5-keto-casbene的C10位上进行连续氧化形成ent-10-oxodepressin。5.以水稻品种Kitaake为背景,分别构建了OsECBS稳定过表达（OE）和CRISPR-Cas9敲除株系（ko）。在WT和OE中共检测到ent-casbene、ent-10-keto-casbene和ent-10-oxodepressin三种casbane型化合物,ko中无相关产物。与WT相比,OE中ent-casbene显著积累,经Cu Cl2处理后,另外两种化合物显著积累;且稻瘟病菌的生长在OE中受到了抑制,而ko株系中则其生长受到促进。萜类多样的生理活性主要由其官能团决定,但目前已报道的绝大多数萜类合酶只能催化相应底物生成含至多一个氧原子的萜烯产物,其他基团的加入则需要后续其他酶的进一步修饰才能形成,这极大地限制了官能团的引入和萜类的生产。本研究在玉米中发现了首个可催化底物生成含两个羟基产物的倍半萜合酶Zm EDS,并使用同源建模、定点突变等方法,进一步解析了其催化机制,为后续解析玉米倍半萜生物学功能和萜类合酶的定向改造提供了研究基础。主要的研究结果如下:1.利用大肠杆菌代谢工程、烟草瞬时过表达体系等技术鉴定Zm TPS17催化FPP的主产物是倍半萜二元醇eudesmane-2,11-diol,因此将其命名为Zm EDS;该基因在玉米幼苗根系中表达量较高,且在玉米根系分泌物中检测到eudesmanediol的积累。2.以烟草5-epi-aristolochene synthase蛋白结构为模板进行同源建模,得到预测的Zm EDS蛋白结构,将其与底物、产物和中间产物的分子结构分别进行分子对接;结合序列比对结果,筛选得到F303等多个位点用于后续研究;对上述位点分别进行定点突变、产物分析,发现多个点突变体明显地改变了Zm EDS的产物组成。3.D2O标记体外催化实验的结果表明,eudesmanediol的催化形成中,溶剂中的一个质子参与了其骨架的形成,加入了C6位;4.对Zm EDS及其突变体中产量较高的产物进行纯化、NMR分析,成功解析了eudesmols、cryptomeridiols、hedycaryol等多种产物的结构;并结合突变体中产物组成的变化,推导了Zm EDS相关位点对催化反应的作用及其经反应中间体hedycaryol后形成主产物的催化机制。