富含二硫键的多肽种类众多,具有各种各样的生物学功能,是大自然中的一个资源宝库。与线性多肽相比,二硫键多肽特异性强,稳定性好,具有开发成药物的良好潜力,正确的二硫键配对是其发挥正常生物学功能的前提。尽管采用基因工程方法成功表达了部分含多对二硫键的芋螺毒素、蝎毒素和蜘蛛毒素,但这些富含二硫键多肽毒素的表达和纯化仍较困难。在确定表达与纯化体系时,要求尽可能考虑到所表达多肽的特性、表达情况、实验支出、表达时长、安全性以及所表达的多肽毒素对表达体系本身的影响。由于多肽毒素分子量很小,并富含二硫键,采用非融合的形式表达有时相当困难,一般情况下采用融合表达的形式,既便于表达多肽的检测和纯化,也有利于增强其可溶性和稳定性。结合多肽毒素的性质,在融合Trx、MBP和His等标签的同时,也建议融合分子伴侣,如小分子泛素样修饰蛋白(sumo)不仅能提高多肽的表达量和可溶性,还具有促进多肽正确折叠和抗蛋白酶水解的功能。随着分子生物学技术的不断发展和多肽毒素自身的深入研究,预计新的适合多肽毒素表达与纯化体系会不断出现,多肽毒素基因表达与纯化的发展在多肽毒素结构和功能研究方面发挥作用也越来越大。本文主要在大肠杆菌pET32a/pETDuet两种表达载体中进行了四种含有三对二硫键的芋螺毒素CnⅢC、GⅢB、KⅢA、PⅢA的表达研究。根据基因序列设计引物,使用双酶切的方法将芋螺毒素GⅢB、PⅢA构建到pET32a表达载体中,芋螺毒素CnⅢC、KⅢA构建到pETDuet-1表达载体中。再通过RF-cloning技术将芋螺毒素PⅢA构建到pETDuet-sumo表达载体。将构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,加入IPTG进行诱导表达,四种芋螺毒素均以上清的形式获得了高效表达。对于GⅢB、PⅢA两个小肽,经两次镍柱纯化、酶切去标签,超滤管纯化得到了纯净的目的多肽。对于CnIIIC、KIIIA两个小肽,先镍柱纯化、酶切后经MBP柱纯化,最后经凝胶色谱柱Superdex 75纯化得到了纯净的目的多肽。经质谱鉴定纯化后的多肽分子量与理论分子量一致,电生理实验表明其具有一定的活性。综上所述,我们成功在大肠杆菌中得到了富含三对二硫键且具有活性的四种芋螺毒素CnⅢC、GⅢB、KⅢA、PⅢA,这不仅给其他富含二硫键的多肽制备提供了参考价值,同时也为外源表达系统大规模生产高活性、低成本、安全性高的重组芋螺毒素奠定了基础。富含二硫键多肽大肠杆菌表达体系的成功建立,将大大加快富含二硫键多肽的基础与应用研究。