研究背景医用生物材料的应用已经成为现代医学发展的一个重要方向,效用价值高的生物材料可以提高人类的生活质量和寿命,但随着大量生物材料的运用,一系列因内植物感染引起的严重并发症成为临床亟待解决的重要问题。大量研究表明,内植物感染之所以难治、严重、耐药,其根本原因是在材料表面形成了结构复杂的细菌生物膜,并在其形成过程中受多种基因的调控。钛(Ti)是临床应用最广泛的金属材料,尤其在骨科,因植入各种以Ti为主要成分的钢板、螺钉而引起的感染呈逐年上升的趋势,其中金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合感染在骨科如慢性骨髓炎、糖尿病足等各类慢性感染中并不少见,因其感染严重、病灶迁延不愈、治疗困难,成为一重要的临床问题。抗菌药物及新型生物材料的研发是目前治疗材料表面感染的两个主要手段。硝酸镓作为一种新型抗菌药物,因Ca3+竞争性取代Fe3+干扰细菌DNA和蛋白质的合成,从而起到抗菌的作用;Ti02纳米管为新型纳米材料具有良好的生物相容性、较高的吸附率、良好的抗菌性等优势。因此本文从混合细菌感染的角度探究金黄色葡萄球菌-大肠杆菌在Ti表面形成混合生物膜的规律,并通过对Ti材料改性,研制新型纳米材料硝酸镓涂层的TiO2纳米管,以探究其对金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合感染的作用。以上的研究将对临床难治性混合感染提供理论依据,对临床防治有重要的意义。本研究的目的:(1)体外研究金黄色葡萄球菌-大肠杆菌是否能在Ti材料表面形成混合生物膜及形成的规律。(2)探讨金黄色葡萄球菌icaA、icaD、sarA基因与大肠杆菌flhC、flhD、qseC基因在混合生物膜形成中的作用。(3)在大鼠体内,探讨硝酸镓涂层的TiO2纳米管材料对金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合生物膜的作用。第一部分钛材料表面金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合生物膜形成的研究[目的]观察金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合生物膜在Ti表面形成的规律,并与Ti表面单一金黄色葡萄球菌、单一大肠杆菌生物膜形成做对照研究。[方法]用Ti片分别与TSB培养基(空白组)、金黄色葡萄球菌TSB菌液(金葡组)、大肠杆菌TSB菌液(大肠组)、金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合TSB菌液(混合组)共培养6h、12h、24h、48h、72h后,采用结晶紫染色法对生物膜进行半定量检测(检测细菌粘附量,细菌生物膜形成能力),XTT法检测细菌生物膜形成的动力,激光共聚焦显微镜观察细菌生物膜形成厚度、能力(活死菌比例)、重建生物膜三维结构,扫描电镜观察细菌生物膜的超微结构。[结果]1.细菌粘附量:培养6h、12h、24h、48h、72h后,空白组、大肠组、金葡组、混合组菌细菌粘附量比较,6h混合组>大肠组(P<0.05);12h混合组>空白组、>大肠组,金葡组>空白组(P<0.05);24h、48h混合组均>大肠组、>金葡组、>空白组(P<0.05);48h金葡组>空白组、>大肠组;24-48h混合组细菌粘附数量最多。2.细菌生物膜成膜能力:培养6h、12h、24h、48h、72h后,空白组、大肠组、金葡组、混合组细菌成膜能力比较,6h四组均未形成生物膜;12h金葡组与混合组形成弱细菌生物膜,两组无差异(P>0.05);24h大肠组、金葡组、混合组均形成弱生物膜,混合组>大肠组(P<0.05);48h大肠组、金葡组形成弱生物膜,混合组形成成熟生物膜,混合组分别>大肠组、金葡组(P<0.05);72h三组均形成成熟细菌生物膜,大肠组分别>金葡组、混合组(P<0.05)3.细菌生物膜生长动力:培养6h、12h、24h、48h、72h后,空白组、大肠组、金葡组、混合组细菌生物膜生长动力比较,培养6h四组生长动力无差异,12h混合组分别>空白组、金葡组、大肠组(P<0.05);24h、48h大肠组、金葡组、混合组比较生长动力无差异(P>0.05),均强于空白组(P<0.05);72h大肠组、金葡组、混合组分别>空白组,混合组<金葡组(P<0.05)。4.激光共聚焦检测:培养12h、24h、48h、72h,每个时间点空白组、大肠组、金葡组、混合组四组比较,混合组结构均最复杂、死菌比例也最高。四组生物膜结构致密性、复杂性:混合组>金葡组>大肠组>空白组;各组生物膜均有随培养时间延长细菌数量增多,结构复杂性增加,但有活菌比例减少,死菌比例增多的趋势。5.扫描电镜:培养12h、24h、48h、72h,金葡、大肠、混合组各组随培养时间延长细菌数量增多,生物膜结构复杂性增强;每个时间点,混合组均可形成金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合生长的混合生物膜,混合生物膜结构比单一金葡、大肠生物膜复杂且混合生物膜中以大肠杆菌生长为主。[结论]1.金黄色葡萄球菌-大肠杆菌能在纯钛材料表面形成由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌混杂生长、结构复杂致密的细菌群体性结构即混合细菌生物膜,混合生物膜以大肠杆菌为主要菌种。2.与单一金黄色葡萄球菌、单一大肠杆菌生物膜相比,混合生物膜随培养时间延长结构致密性与复杂性上升,虽细菌总数增多,但生长动力减弱,这可能与混合生物膜中金黄色葡萄球菌-大肠杆菌之间存在一种竞争的关系且大肠杆菌有竞争优势相关。第二部分金黄色葡萄球菌icaA、icaD、sarA基因与大肠杆菌flhC、flhD、qseC基因在混合生物膜形成中的作用[目的]探讨金黄色葡萄球菌icaA、icaD、sarA基因与大肠杆菌flhC、flhD、qseC基因在混合生物膜形成中的表达情况。[方法]用实时荧光定量PCR法检测金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合生物膜中金黄色葡萄球菌icaA、icaD、SarA基因与大肠杆菌flhC、flhD、qseC基因在金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合生物膜的相对表达量。[结果]培养48h后,与单一金黄色葡萄球菌生物膜,单一大肠杆菌生物膜相比,混合生物膜中金黄色葡萄球菌icaA基因下调表达0.62±0.01倍(P<0.05),icaD基因上调表达 5.03±0.75 倍(P<0.05),sarA 基因上调表达 10.72±0.97 倍(P<0.05);大肠杆菌flhC(、flhD、qseC基因均上调表达,flhC基因上调表达383.78±88.01倍(P<0.05),flhD 基因上调表达 468.69±107.65 倍(P<0.05),qseC 基因上调表达 561.11±121.48 倍(P<0.05)。[结论]金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合生物膜与单一金黄色葡萄球菌、单一大肠杆菌生物膜相比icaD、SarA基因上调表达、icaA基因下调表达,flhC、flhD、QseC基因均上调表达,可能与混合生物膜中金黄色葡萄球菌-大肠杆菌存在相互竞争且大肠杆菌占优势有关。第三部分硝镓涂层的TiO2纳米管对金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合细菌生物膜形成的影响[目的]在大鼠体内,探讨硝酸镓涂层的Ti02纳米管材料对金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合生物膜形成的影响。[方法]1.用阳极氧化法制备Ti02纳米管,扫描电镜观察其形貌特征。2.采用溶剂浇铸技术制备硝酸镓涂层的Ti、TiO2纳米管材料,并用扫描电子显微镜观察其形貌特征。3.用金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合菌液与TiO2纳米管共培养24h,扫描电镜观察在TiO2纳米管材料表面是否能形成混合细菌生物膜及并观察其超微结构。4.将Ti、TiO2纳米管、硝酸镓涂层的Ti、硝酸镓涂层Ti02纳米管四组材料植入SD大鼠体内,同时加入混合菌液进行体内培养,饲养3天、7天、14天后,观察动物一般状态(体重、精神、活动),处死动物后检测切口及体内感染情况,局部感染组织HE染色观察,激光共聚焦显微镜观察体内Ti片细菌生物膜形成情况,扫描电镜观察细菌生物膜的超微结构。[结果]1.材料形貌:TiO2纳米管表面呈现哑光暗黄色,有一定的粗糙度。电镜观察到Ti02纳米管为多孔致密管状结构,上端开口,低端封闭与钛基相连,排列整齐,孔径大小均一,平均管长7.12 ±0.13 μ m,直径为146.72 ±13.14 μm。硝酸镓涂层的Ti及TiO2纳米管可见纳米管口被一层均一薄层状物质覆盖,材料表面有大小不等的块状物质覆盖。2.体外培养24h后混合细菌在Ti02纳米管材料表面形成了以大肠杆菌为主的微弱细菌生物膜。3.动物观察:术后3天、7天、14天四组活动情况及体重状况无差异,硝酸镓涂层的TiO2纳米管组动物切口感染最轻,体内组织感染最轻,组织修复能力最强,电镜及激光共聚焦观察硝酸镓涂层的Ti及TiO2纳米管材料表面均未见成熟细菌生物膜形成。[结论]1.硝酸镓涂层的Ti02纳米管有抑制金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合细菌生物膜形成的作用。2.TiO2纳米管材料表面进行硝酸镓涂层是防治金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合感染的一种新方法。