沙门菌(Salmonella)是一种人兽共患病原菌,其感染后,能够在宿主细胞内存活,从而造成严重的带菌状态,带菌食源性动物是引起人和动物沙门菌病的主要来源之一。因此,若能抑制沙门菌在体内的定殖对于控制沙门菌病具有重要意义。巨噬细胞(macrophages,Mφs)是天然免疫系统的一种重要细胞,同时,又是沙门菌感染的主要宿主细胞,所以,Mφs是研究沙门菌与细胞互作的良好模型。在Mφs中,NLR (NOD-like receptor)能够识别胞质中与致病相关的微生物成分,诱导炎性体信号应答。但沙门菌在细胞内能逃避该机制介导的应答,如果能增强炎性体活性,则有利于清除沙门菌感染。研究初步显示,增强炎性体应答的胞内菌减毒疫苗,可发挥较好的免疫保护作用。本研究从Mφs对沙门菌感染的应答分析入手,构建能够增强炎性体活性的重组菌,以小鼠为动物模型,探讨炎性体活性的增强在抗沙门菌感染中的作用。1、巨噬细胞对沙门菌感染的应答测定Mφs吞噬灭活的沙门菌后,可诱导吞噬体的成熟而将其清除。Mφs吞噬活的沙门菌后,除了形成吞噬体外,更多的是由于沙门菌的调控作用,在细胞内形成适合其生存的空泡(Salmonella-containing vacuole)。因此,探索Mφs对沙门菌感染的应答与吞噬体机制的差异,将为控制沙门菌病提供新的认识。为了探索小鼠腹腔Mcps (peritoneal macrophages, PMs)对沙门菌感染的应答,本实验以灭活的肠炎沙门菌(C50041-d)为对照,分析C50041感染(MOI=150)短时间内Mφs的应答情况。结果表明,从细胞形态看,C50041感染细胞的细胞膜严重受损,而C50041-d组与未感染组类似。在对细胞的毒性方面,C50041感染细胞中LDH的释放显著高于C50041-d组(p<0.05)。在上调共刺激分子的表达方面,两者变化趋势一致。在细胞代谢功能方面,两组在细胞内pH、[Ca2+]、线粒体膜电位、活性氧和NO的产生等方面的变化趋势一致,但C50041感染引起的变化早于C50041-d。在自噬标志的检测方面,C50041感染细胞中LC3的表达水平低于C50041-d,感染4.5h后,C50041感染组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率也低于C50041-d组。在免疫应答方面,感染4h后,C50041感染组细胞培养上清中TNF和IL-6的含量显著低于C50041-d组(p<0.05),而IL-1p的分泌显著高于C50041-d组(p<0.05)。并且,C50041感染细胞中caspase-1的激活程度也显著高于C50041-d(p<0.05)。这说明,Mcps内炎性体通路对沙门菌感染的应答能力更强。2、增强炎性体活性的重组沙门菌的构建与鉴定沙门菌感染初期,能够激活炎性体信号应答。但是,沙门菌进入细胞后,能通过调节细胞功能,从而降低或逃避炎性体应答。因此,如果要分析炎性体通路的激活对沙门菌定殖的影响,则需要构建能够增强炎性体活性的重组菌。已知,沙门菌SspH2蛋白的N-端可以将外源蛋白运送到细胞质中,E coli的EscI蛋白的C-端能激活细胞内的NLRC4炎性体途径。本实验利用overlap PCR技术,将沙门菌C50041的sspH2基因5’-端序列(1-453bp)与E coli的escI基因3’-端序列(205-426bp)连接(末端含有flag标签基因),并将SspH2-EscI基因克隆至pMD20T载体,酶切鉴定正确。序列测定结果表明,SspH2-EscI基因序列共711bp,(C+G)%为49.79%。序列比较分析发现,不同沙门菌菌株间sspH2基因的5’-端序列中有4个碱基存在差异,不同E.coli菌株间的escI基因的3’-端序列差异较大,并且,它们的差异位点均相对集中。用Nco Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切SspH2-EscI基因,并插入原核表达载体pYA3334的相应位点,重组质粒pYA3334-SspH2-EscI转化E coli X6212,质粒酶切鉴定正确后,将重组质粒pYA3334-SspH2-EscI依次转化减毒沙门菌X3730与X4550。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果表明,成功构建出表达融合蛋白SspH2-EscI的重组沙门菌X4550(pYA3334-SspH2-EscI)。体外感染实验表明,重组菌X4550(pYA3334-SspH2-EscI)够显著增强诱导小鼠PMs细胞产生IL-1p的能力(p<0.05)。体内感染实验表明,静脉注射感染小鼠后,X4550(pYA3334-SspH2-EscI)在肝脏和脾脏中的定殖能力显著降低(p<0.05)。这说明,该重组菌感染细胞后,激活炎性体机制的能力增强。3、重组沙门菌诱导的抗感染免疫应答分析以小鼠为动物模型,以X4550(pYA3334)为对照,分析重组菌X4550(pYA3334-SspH2-EscI)诱导的抗感染免疫应答情况。静脉注射(1×106cfu/只)免疫分析结果表明,免疫1周后,X4550(pYA3334-SspH2-EscI)免疫组小鼠脾脏变化不明显,而X4550(pYA3334)免疫组则明显肿大；并且X4550(pYA3334-SspH2-EscI)免疫组肝脏和脾脏的坏死程度也弱于X4550(pYA3334)组。免疫2周后,)C4550(pYA3334-SspH2-EscI)免疫组T淋巴细胞亚群的比值(CD4/CD8)显著降低(p<0.05),而X4550(pYA3334)组则略有升高；在T淋巴细胞的激活方面,两组虽然均显著高于未免疫组(p<0.05),但X4550(pYA3334-SspH2-EscI)组低于X4550(pYA3334)免疫组。血清学分析结果表明,细胞因子的表达量均处于较低的水平。免疫1周后,腹腔注射野生型鼠伤寒沙门菌D6,分析小鼠的死亡情况发现,相对于X4550(pYA3334)免疫组,X4550(pYA3334-SspH2-EscI)免疫组的保护效力显著提高。腹腔注射(1×106cfu/只)免疫分析结果表明,虽然X4550(pYA3334-SspH2-EscI)免疫组的体内定殖能力降低,但其免疫保护效力未见明显提高。而且,在强毒菌株攻击后,X4550(pYA3334-Ssph2-EscI)免疫组小鼠的状态较差。以上结果表明,不同免疫途径对增强炎性体活性的重组沙门菌的安全性和免疫保护效力有影响。本研究为炎性体机制及其应用价值的研究提供了重要数据。