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青蒿素是从我国传统药用植物青蒿(Artemisia annua L.)的地上部分提取出的一种抗疟特效药。青蒿植株中青蒿素的含量很低(0.01-0.8％DW)，导致青蒿素类抗疟药物成本较高，而疟疾的高发区多为亚非拉的贫穷落后的国家，因此降低药物的价格尤为重要。青蒿是获取青蒿素的唯一来源，故提高青蒿中青蒿素的含量是降低青蒿素类药物成本的关键所在。近年来，对青蒿中青蒿素生物合成途径及其调控的研究已成为各个国家科学家关注的热点，尽管已取得一些突破性研究进展，但青蒿素含量的提高仍然有限。为此，本论文围绕青蒿素生物合成的调控开展了以下两个方面的工作：
1.FPS、ADS融合基因对青蒿素生物合成的调控
法呢基焦磷酸合酶(FPS)和紫穗槐二烯合酶(ADS)是青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶，将这两个酶进行融合表达，以提高其催化效率，并探讨融合酶在不同的亚细胞分区表达对青蒿素生物合成的调控作用，提高转基因青蒿中青蒿素的含量。此外，烟草的叶片比青蒿大得多，而且烟草表面也有分泌型腺毛，因此我们开展了在烟草中进行青蒿素组合生物合成的研究，将青蒿素生物合成相关酶基因转入烟草中表达，以期通过转基因烟草来生产青蒿素或者其生物合成前体。
1.1融合酶、含质体导肽序列融合酶植物表达载体构建
利用Sticky-end PCR方法将融合酶基因(FA)插入植物表达载体pBI121L的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建融合酶植物表达载体pBIFA。从拟南芥中扩增到了300 bp的Rubisco小亚基质体导肽序列(TP)，将导肽序列和融合酶基因(FA)依次插入植物表达载体pBI121L，构建含质体导肽序列的融合酶植物表达载体pBITPFA。
1.2烟草组合生物合成青蒿素研究
将构建好的植物表达载体pBIFA和pBFTPFA分别转化烟草，通过基因组PCR筛选得到了26棵转pBIFA烟草和19棵转pBITPFA烟草。转pBIFA和转pBITPFA烟草中紫穗槐二烯含量最高分别为0.012μg/g FW和0.6μg/g FW，明显高于单转ADS基因的转基因烟草(<2ng/g FW)，增加质体导肽序列则可以使紫穗槐二烯含量提高约50倍，是单转ADS烟草中紫穗槐二烯含量的300倍。在获得高含量紫穗槐二烯转基因烟草基础上，通过二次转化将青蒿素生物合成途径中的下一个酶，细胞色素P450氧化酶(CYP71AV1)转入能合成紫穗槐二烯的转基因烟草中。在二次转化转基因烟草中，融合酶基因、细胞色素P450氧化酶基因都插入了烟草基因组。转基因烟草中化合物的检测工作正在进行中。
1.3青蒿遗传转化体系的优化
青蒿的遗传转化效率很低，阻碍了利用FPS、ADS融合基因进行青蒿中青蒿素生物合成调控的研究，本论文对影响青蒿遗传转化效率的一些因素进行了探索，结果发现，2 mg/l的AgNO3处理20 d能促进青蒿丛生芽的产生和生长，丛生芽诱导率提高了25％。2 mg/l AgNO3还能促进再生植株的生长。硝酸银处理不会影响青蒿丛生芽对卡那霉素的敏感性。因此，可以将硝酸银用于青蒿的遗传转化，通过提高不定芽的再生频率来提高青蒿遗传转化的效率。
利用青蒿瞬时表达体系研究了Silwet L-77、乙酰丁香酮(As)、真空渗透时间、共培养时间对青蒿转化效率的影响。结果表明75μl/l的Silwet L-77可以使青蒿外植体中GUS活性提高2.6倍；200μM的As可以使青蒿外植体中GUS活性提高64％。真空渗透可以促进青蒿的转化，对瞬时表达来说合适的真空渗透时间是10 min；共培养3-4 d时GUS活性最高，达到90.33 mmolMU/min/μgprotein。
2.壳聚糖对青蒿素生物合成的调控
研究了不同浓度壳聚糖对青蒿植株中青蒿素生物合成的影响，结果表明100 mg/l壳聚糖能明显提高青蒿植株中青蒿素的含量。100 mg/l壳聚糖处理后8 h时青蒿素含量开始增加，处理后48 h时达到16.9 mg/g，比对照提高了53％。青蒿酸含量在壳聚糖处理后变化不明显；二氢青蒿酸含量在处理后8 h时明显高于对照，到24 h时比对照提高了72％，到48 h后开始缓慢下降。壳聚糖处理促进了青蒿体内活性氧的产生，O2-和H2O2含量在处理后2 h开始增加，到处理后8 h和48 h达到最高，分别是对照的3倍和1.5倍。壳聚糖激发了青蒿素生物合成途径中酶基因的表达，除了FPS在壳聚糖处理后变化不是很明显外，HMGR、ADS、CYP71AV1、DBR2基因的表达水平都明显增加，DXP途径中的3个关键酶基因DXS、DXR和ISPH在壳聚糖处理后表达水平都有所提高。这些研究结果表明，壳聚糖从两个方面促进青蒿素的生物合成，一方面壳聚糖通过激活青蒿素生物合成途径相关酶基因表达促进青蒿素前体物质的合成；另一方面壳聚糖促进了青蒿植株中活性氧的积累，增加的活性氧进而促进二氢青蒿酸转变为青蒿素。另外壳聚糖不会影响青蒿植株的生长，因此可以在青蒿收获前2 d通过喷施壳聚糖来快速、有效地提高青蒿素的产量。