论文部分内容阅读
疫病是影响养羊业发展的因素之一。每年因疫病的发生而导致的经济损失不容小觑。本研究应用ELISA检测方法对甘肃、内蒙、陕西和新疆四个省区的羊血清样品进行五种疫病的血清学调查。采集羊病变肺脏组织,利用分离培养和分子生物学方法对病原菌进行分离和鉴定,获得了多杀性巴氏杆菌分离株。对分离株进行生化实验和药敏实验分析,探究该分离株的生长特性。由于多杀性巴氏杆菌血清抗原和荚膜抗原类型的数量繁多,导致不同菌株免疫原性不一。因此,本研究选取同源性较高的OmpA基因进行原核表达,初步探究该蛋白的表达条件,为后续疫苗的研究奠定基础。主要实验结果如下:1.五种疫病的血清学调查收集甘肃、内蒙、陕西和新疆地区的450份羊血清样品,利用ELISA试剂盒检测血清中的五种抗体。实验发现,传染性胸膜肺炎抗体和巴氏杆菌抗体阳性率较高,分别为98%和94.22%。羊口疮病毒抗体和魏氏梭菌抗体阳性率中等,分别为6.44%和7.78%。副结核抗体阳性率最低,只有0.07%。将样品按照地区分类后,发现新疆、甘肃、陕西和内蒙地区的血清样品中的抗体阳性率呈现相近的趋势。对血清中同时存在的抗体种类统计后,发现存在两种抗体的血清数量占总样品的83.78%,其中存在巴氏杆菌抗体和传染性胸膜肺炎抗体的血清占83.33%,存在魏氏梭菌抗体和传染性胸膜肺炎抗体的血清占0.22%,存在羊口疮病毒抗体和魏氏梭菌抗体的血清占0.22%。预示着羊群遭受巴氏杆菌和支原体的混合感染最为严重。2.多杀性巴氏杆菌的分离及药物敏感性分析采集病羊肺脏组织病料进行研磨处理,将过滤液涂布于血清TSA培养基。长出菌落后重复多次划线培养,获得优势菌落。对该优势菌落进行革兰氏染色和分子生物学鉴定,最终获得一株多杀性巴氏杆菌。对该菌株进行药敏分析后,发现四环素、阿莫西林、卡那霉素、头孢他啶、磺胺甲恶唑等药物对其有抑制作用。依据此结果,可为巴氏杆菌病的治疗和控制提供参考。对多杀性巴氏杆菌致病性分析,以不同剂量的多杀性巴氏杆菌对小鼠腹腔注射100μL,发现注射量达10~2cfu/m L时,会导致小鼠在6 h内开始死亡,24 h内全部死亡,提示该菌株具有较强的致病性。3.多杀性巴氏杆菌OmpA蛋白的原核表达利用p ET-28a原核表达系统对多杀性巴氏杆菌OmpA基因进行蛋白表达。首先构建重组质粒p ET-28a-OmpA,将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白,发现可以表达出约40 ku的重组OmpA蛋白。然后对该蛋白表达条件优化后发现,最佳诱导条件为1 m M IPTG、诱导6 h。最后对该蛋白的抗原性和可溶性进行分析,发现带有His标签的重组OmpA蛋白为包涵体蛋白。