叶片不仅是植物重要的光合器官,而且是许多蔬菜的产品器官。植物黄色叶片突变体通常表现生长缓慢,但大白菜橙色叶球不仅生长正常、而且提高了大白菜品质,因此研究不同黄(橙)色叶片形成的分子机理及其效应具有重要的理论与实际意义。本研究分别以橙色叶球大白菜和拟南芥黄色幼叶突变体为试材,通过遗传定位、图位克隆等分离鉴定了大白菜橙色叶球和拟南芥黄色幼叶的关键基因,并对这两个基因的序列结构、表达模式等进行了分析,通过拟南芥同源突变体的功能互补试验验证了其功能,且进一步研究了突变体对相关代谢途径的影响,初步明确了大白菜橙色叶球和拟南芥黄色幼叶形成的分子机理,一方面丰富了植物类胡萝卜素代谢调控理论、为橙色叶球大白菜遗传改良提供理论依据和技术支撑;另一方面为深入研究核糖体蛋白基因PRPS5对植物生长发育的影响奠定了基础。论文取得了如下主要结果:1.以橙色球叶突变体11S39-2为母本,白色叶球大白菜11J16为父本,构建一个含有1724单株的F2S4的遗传分离群体,通过精细和图位克隆发现BrCRTISO与橙色叶球性状共分离。2.通过分段克隆及序列拼接的方法获得了橙色叶球大白菜Brcrtiso基因全长。与普通白色大白菜相比,橙色叶球大白菜在3’末端有501 bp的插入,在编码区存在两个氨基酸的差异,同时在启动子区域还存在88 bp的缺失。3.根据橙色和白色大白菜Br-or启动子区域的88 bp缺失开发了大白菜橙色叶球的功能标记Br-Pro-Indel,该功能标记能在种苗期就能准确区分橙色和白色叶球,提高了橙色叶球大白菜的育种效率。4.橙色叶球大白菜中主要积累前番茄红素和光异构而形成的番茄红素,而白色叶球大白菜主要积累β-胡萝卜素和叶黄素。5.BrCRITSO的表达在橙色和白色叶球大白菜中并没有显著的差异。同时发现其他的类胡萝卜素相关基因的转录丰度在橙色和白色叶球大白菜中也没有大的差异。Western分析表明,PSY和ZEP蛋白水平在橙色和白色叶球大白菜中的差异不显著,与基因表达水平结果相一致。6.通过对拟南芥atcrtiso突变体的互补分析来检测导致橙色叶球产生的原因。结果显示:过表达普通大白菜brcritsocdna全长(35s-brcritso)和包含2个snp但是不含有3’端大片段插入的橙色叶球大白菜brcrtiso?cdna(35s-brcrtiso?),能够完全互补atcrtiso突变体,其表型跟野生型完全相同,过表达橙色叶球大白菜brcrtisocdna全长(35s-brcrtiso)却不能互补拟南芥atcrtiso突变体。这些结果表明两个氨基酸的替换并没有影响crtiso蛋白的功能,而3’端大的插入却可能导致产生了没有功能的crtiso蛋白,最终导致了橙色表型的产生。7.利用新一代高通量illumina/solexa测序技术,对橙色和白菜近等基因系成熟球叶进行了rna-seq分析。结果表明:与白色叶球材料相比,橙色材料中一共有372个基因有显著性差异(pvalue<0.05),相对表达量上调的基因有162个,下调基因有210个。mapman功能分类表明至少20个代谢途径发了变化,尤其是rna、蛋白代谢、信号和胁迫等代谢途径。在这些变化的代谢过程中,很多转录因子(golden2-like、myb、tcp、ap2/erebp、wrky和bhlh)在橙色叶球材料中表达量降低。这些转录因子调节多个植物生长发育过程,包括果实叶绿体转化、发育和胁迫反应等。8.拟南芥突变体的第一片真叶为黄色且叶片比野生型细,第一片真叶长出的时间比对照迟两天,突变体的成熟期叶片、花和茎为淡绿色,植株整体长势也比较弱。在f2遗传分离群体中,野生型与黄色突变体的分离比为3:1,说明黄色突变性状是由单个隐性基因决定的。9.拟南芥突变体4周叶片中总叶绿素含量显著降低,叶绿素a/b比例也发生了改变。hplc分析表明:类胡萝卜素组分在黄叶突变体中并没有发生改变,但是类胡萝卜素含量却降低了,尤其是β-胡萝卜素。10.在ms培养基上,拟南芥突变体的主根长度比野生型的短,表明该基因可能跟生长素的平衡及信号调节相关。但是当在ms培养基中外源施加100nm的naa时,没能互补突变体较短的主根,且naa对野生型主根的长度抑制作用比突变体的严重,这表明与野生型相比突变幼苗对生长素类似物的敏感度低。11.图位克隆了at2g33800基因,并发现该基因第一个外显子n-末端区域有一点突变(g-a),这个点突变导致第180个氨基酸gly替换成了glu,且该点突变与黄叶突变性状共分离。12.构建了prps5的gfp表达载体35s:prps5-gfp,在4周烟草中瞬时表达发现,该基因位于叶绿体上。同时构建了其等位基因的gfp表达载体35s:prps5-gfp,比较分析发现,二者的定位模式完全相同,这表明点突变并没有改变其亚细胞定位结果。13.拟南芥突变体中叶绿体成熟16S rRNA显著降低,而叶绿体16S r RNA前体却显著增加。14.拟南芥突变体中叶绿体光系统I、II及生长素相关基因的表达水平没有明显差异,但是与叶绿体相关蛋白的表达水平却显著改变。15.iTRAQ比较蛋白质组学分发现:在有显著性差异的蛋白中,上调蛋白有58(≥1.33)个,下调蛋白(≤0.75)有86个。与野生型相比,PRPS5蛋白水平下降了约43%,这与双向电泳检测结果相一致。MapMan功能分类显示,变化的蛋白主要包含在光合作用、蛋白、胁迫、氧化还原反应和氨基酸代谢等过程中,尤其是光合作用和蛋白质合成相关途径。下调蛋白分析发现,PRPS5突变特异影响一些光系统I、光系统II、发育相关和胁迫相关的蛋白,这些蛋白表达的下调可能是导致黄叶和发育缺陷的原因。