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研究背景支气管哮喘是以气道炎症为主要病理特征的气道疾病之一。近20年来,支气管哮喘的发病率持续增加,全球支气管哮喘患者人数已逾3亿。金黄色葡萄球菌(简称金葡菌,staphylococcus aureus,SA)作为自然界中最常见的革兰氏阳性病原体,已经成为哮喘等慢性气道炎症性疾病最主要的危险因素之一。此外,研究发现Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)信号通路调控自噬和炎症因子的释放,参与了哮喘的发病机理。因此,我们采用金葡菌刺激小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7为研究对象,在细胞水平观察TLR2对金葡菌诱导肺泡巨噬细胞自噬和炎症反应的影响。研究目的探讨肺泡巨噬细胞表面受体TLR2在金葡菌诱导巨噬细胞自噬和炎症反应中的潜在分子机制。研究方法1.检测巨噬细胞受到不同时间金葡菌刺激后自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7受到不同时间金葡菌刺激后,通过Western blot和ELISA方法检测巨噬细胞受到刺激后自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达水平;通过激光共聚焦扫描显微镜观察巨噬细胞内自噬溶酶体的数量。2.RNA干扰TLR2对金葡菌诱导巨噬细胞自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白表达的影响检测用金葡菌刺激TLR2 si RNA干预的RAW264.7巨噬细胞2h后,通过Western blot和ELISA方法检测TLR2 si RNA干预的巨噬细胞受到金葡菌刺激后自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达水平;通过激光共聚焦扫描显微镜观察巨噬细胞内自噬溶酶体的数量。3.特异性抑制PI3K信号通路对金葡菌诱导巨噬细胞自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白表达的影响检测用金葡菌刺激PI3K特异性抑制剂3-MA干预的RAW264.巨噬细胞2h后,通过Western blot和ELISA方法检测3-MA干预的巨噬细胞受到金葡菌刺激后自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达水平;通过激光共聚焦扫描显微镜观察巨噬细胞内自噬溶酶体的数量。研究结果1.金葡菌诱导巨噬细胞自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞受到不同时间的金葡菌刺激后,TLR2、My D88、PI3K和p-NF-κBp65信号通路蛋白的表达随时间依赖性的方式显著增加;与此同时,自噬蛋白Beclin-1、LC3-II和促炎症因子TNF-α和IL-6的表达以及巨噬细胞中自噬溶酶体的表达数量也随时间依赖性的方式显著增加。2.TLR2对金葡菌诱导巨噬细胞自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达至关重要金葡菌刺激TLR2 si RNA干预的RAW264.巨噬细胞2h后,TLR2、My D88、PI3K和p-NF-κBp65信号通路蛋白的表达显著受到抑制;与此同时,自噬蛋白Beclin-1、LC3-II和促炎症因子TNF-α和IL-6的表达以及巨噬细胞中自噬溶酶体的表达数量也明显受到抑制。3.PI3K信号通路对金葡菌诱导巨噬细胞自噬蛋白和促炎症因子以及NF-κB信号通路蛋白的表达至关重要用金葡菌刺激PI3K特异性抑制剂3-MA干预的RAW264.巨噬细胞2h后,PI3K和p-NF-κBp65信号通路蛋白的表达显著受到抑制;与此同时,自噬蛋白Beclin-1、LC3-II和促炎症因子TNF-α和IL-6的表达以及巨噬细胞中自噬溶酶体的表达数量也明显受到抑制。研究结论1.金葡菌能够诱导巨噬细胞活化自噬和炎症反应。2.TLR2信号通路能够调控金葡菌诱导巨噬细胞活化自噬和炎症反应。3.TLR2能够通过PI3K信号通路调控金葡菌诱导巨噬细胞活化自噬和炎症反应。