一、研究背景与目的　　血管内皮细胞(VEC)是循环血液与血管平滑肌间的机械屏障。VEC的功能相当广泛,除起转运屏障作用外,还具有分泌功能，可以合成分泌多种物质,对调节血管紧张度、血液流通、细胞生成、炎症反应、免疫等功能具有重要作用。多种因素可通过不同机制与途径损伤血管内皮细胞，使内皮屏障作用减弱，血中脂蛋白过多地进入动脉壁沉积下来，被清道夫细胞吞噬形成泡沫细胞；内皮细胞受损后，炎细胞、血小板的粘附与内容物的释放又加重了内皮细胞损伤，从而逐渐形成粥样硬化斑块，因此寻找一种应用方便、专一性强、来源丰富、效果良好的VEC保护剂也越来越引起人们的重视。　　本课题以血管内皮细胞为靶细胞，以卵泡抑素相关蛋白（FRP）为主要研究对象，以Western Blot、Si-RNA、Rt-PCR、ChIP assay等实验技术为研究手段，重点探讨FRP对VEC的保护作用，力求阐明该蛋白对VEC的抗凋亡机制及其在动脉粥样硬化中的病理意义。　　二、材料与方法　　1、根据验证样性的基因编码序列获得FRP编码区cDNA连接于表达载体pET32a，构建表达重组子，转化入 Origami（DE3），1mM IPTG诱导蛋白表达，使用Ni-NTA His Band Resins，Sephacryl S-100纯化蛋白，肠激酶酶切融合蛋白并鉴定。　　2、分离脐带静脉血管内皮细胞，并用含有胎牛血清的1640完全培养基进行细胞培养，每2-3天换液一次，定期进行消化传代。　　3、将C段带有FLAG标签的FRP基因片段连接到pcDNA4/TO上，先后将pcDNA6/TR和pcDNA4/TO/FRP-FLAG转染至内皮细胞系EAHY926中，用blasticidin和zeocin筛选稳定转染的单克隆细胞。　　4、制备ApoE基因敲除小鼠为背景的FRP转基因动物，ApoE基因缺陷小鼠与ApoE基因缺陷FRP转基因小鼠，构建动脉粥样硬化动物模型。　　5、通过PI-Annexin-V双染后流式细胞仪分析，研究FRP重组蛋白FRP抗ox-LDL诱导的细胞凋亡维持HUVEC的细胞活性。　　6、通过rt-PCR WesternBlot等方法检测FRP下游抗凋亡蛋白。　　三、结果　　1.给予ApoE缺失小鼠及ApoE基因缺陷-FRP转基因小鼠喂养12周。TUNEL提示ApoE缺失小鼠动脉粥样硬化斑块形成后血管内皮细胞凋亡增加；ApoE基因缺陷-FRP转基因小鼠TUNEL染色显示凋亡的内皮细胞显著少于ApoE组。用oxLDL的终浓度依次为0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、50ug/ml（0ug/ml oxLDL作为对照组）处理HUVECs直接影响FRP的表达，结果发现处理后HUVECs的FRP表达量与oxLDL的浓度呈反比。　　2.细菌可溶性的蛋白经Ni-His band及Sephadex Sephacryl S-100纯化酶切蛋白后，得到目的蛋白。　　3.用浓度为50ug/ml的ox-LDL处理HUVECs，与对照组相比细胞变圆，贴壁细胞减少。100ng/ml的FRP重组蛋白可以抗ox-LDL诱导的细胞凋亡。MTT检测提示，随着ox-LDL浓度的增加，内皮细胞的存活能力逐渐降低；不同浓度的FRP和ox-LDL对内皮细胞进行处理时，发现FRP可以抵抗ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡，当FRP浓度为100ng/ml时有显著性差异。FRP浓度大于80ng/ml时可显著提高细胞活性。FACS提示FRP可显著降低凋亡早期annexin V阳性细胞数。　　4.按如下方法处理细胞24小时：1、空白对照组+50μg/ml LDL.2、+50μg/ml oxLDL.3、+50μg/ml oxLDL+50ng/ml FRP.4、+50μg/ml oxLDL+75ng/ml FRP.5、+50μg/ml oxLDL+100ng/ml FRP。实验发现，FRP可以上调磷酸化Akt的表达，从而激活磷酸化Akt的下游基因——磷酸化Bad的表达。然而，Akt的表达量并未随着FRP的表达量而改变，Bcl2的表达量随着FRP浓度的增高而显著性增加。　　5.利用转染Bcl2 siRNA的方法抑制Bcl2的蛋白表达，可使Bcl2蛋白表达量降低约50％（Scramble RNA组为对照组）。用FRP诱导Bcl2表达发现Bcl2 siRNA组与对照组相比Bcl2的表达量无明显增加。在Scramble RNA组中可以观察到FRP对ox-LDL诱导的HUVEC凋亡仍有保护作用，而在Bcl2 siRNA组，FRP的保护作用丧失。　　四、结论　　本次课题体内和体外实验都证实了ox-LDL通过抑制内皮细胞中FRP的蛋白表达从而诱导内皮细胞凋亡；同时发现，FRP是通过转录水平上调Bcl2的蛋白表达从而抑制ox-LDL诱导内皮细胞凋亡，发挥其抗内皮细胞凋亡、延缓动脉粥样硬化发展的功能。