动物的繁殖机能主要是受促性腺激素释放激素神经元(gonadotropin-releasing hormone neurons,GnRH neurons)调控,GnRH神经元合成分泌的GnRH以脉冲的方式从正中隆起释放进入垂体门脉系统,到达腺垂体并特异性地与促性腺细胞上的受体结合,刺激腺垂体合成和分泌LH、FSH,最终调节动物的生殖行为。星形胶质细胞(astrocytes,AST)是一种特殊的胶质细胞,连续地分布于整个中枢神经系统,执行着复杂的功能。近年来,随着学者们对星形胶质细胞的深入研究发现,除了GnRH神经元,星形胶质细胞分泌的胶质因子PGE2能够通过调节GnRH神经元的活性和分泌来间接调节动物的繁殖。然而,GnRH神经元分泌的GnRH能否反馈调节星形胶质细胞仍没有报道。本实验利用体外培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞,探究GnRH对星形胶质细胞分泌PGE2的调控机制。其主要目标为:(1)探究星形胶质细胞上是否存在GnRHR;(2)在体外条件下,GnRH是否影响培养星形胶质细胞中PGE2的表达;(3)COX在GnRH调节星形胶质细胞分泌PGE2中的作用;(4)MAPK信号通路是否参与GnRH对星形胶质细胞PGE2表达的调节。为了有效研究GnRH对体外培养星形胶质细胞PGE2表达的影响,研究如下:(1)实验选取1–3日龄的SD新生大鼠,分离下丘脑进行原代和传代培养,并多次纯化达到纯化率为99%以上的星形胶质细胞,为后续研究提供了大量高纯度、符合要求的细胞。(2)为了探究星形胶质细胞上是否存在GnRHR,实验利用免疫荧光、基因测序及Western Blot方法检测星形胶质细胞上是否存在GnRHR,结果显示星形胶质细胞上存在GnRHR,为后续研究奠定基础。(3)为了探究GnRH对培养星形胶质细胞中PGE2表达的影响,实验选取10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L、10-6 mol/L的GnRH刺激体外培养的星形胶质细胞,分别在1 h、6 h、12 h、24 h、48 h通过ELISA检测细胞培养液中PGE2的表达量。结果显示,12h时10-10mol/lgnrh处理组与对照组相比pge2的表达量升高,且差异显著(p<0.05);10-8mol/l和10-6mol/l的gnrh处理组与对照组相比pge2的表达量减少,且差异显著(p<0.05)。(4)为了探究cox在gnrh调节星形胶质细胞分泌pge2中的作用,实验选取10-10mol/lgnrh刺激细胞,通过荧光定量pcr、elisa和westernblot检测在1h、6h、12h、24h、48h时cox-1和cox-2的mrna和蛋白的表达水平。结果显示,cox-1mrna的表达量在12h时增加,cox-2mrna的表达量在6h和12h时显著增加,与cox-1相比上调量更大;通过elisa和westernblot检测结果发现,12h后cox-1和cox-2的表达量均上调,且cox-2比cox-1上调幅度更大,表明cox-2与cox-1相比起更主要的作用。为了验证gnrh刺激星形胶质细胞后是否通过上调cox-1和cox-2而引起pge2的表达升高,分别用50nmol/lsc-560和3μmol/lns-398预处理星形胶质细胞后,通过elisa检测上清中pge2含量。结果显示,gnrh+sc-560组和gnrh+ns-398组对gnrh诱导星形胶质细胞分泌的pge2均有抑制作用,而且ns-398对细胞分泌pge2的抑制作用更强。表明cox-1和cox-2对gnrh诱导星形胶质细胞分泌的pge2均有影响,而且cox-2起更主要的作用。(5)为了研究p38、jnk、erk三条经典的mapk信号通路在gnrh调节星形胶质细胞分泌pge2中的作用,实验选取20μmol/lp38抑制剂sb203580、10μmol/ljnk抑制剂sp600125、10μmol/lerk抑制剂u0126预处理星形胶质细胞后分别加入10-10mol/lgnrh预处理星形胶质细胞12h,通过elisa检测上清中pge2的含量。结果显示,三种抑制剂均能够抑制gnrh上调的pge2,且u0126的抑制效果最明显,表明p38、jnk、erk信号通路对gnrh诱导星形胶质细胞分泌pge2的过程具调控作用,其中erk信号通路对其调控作用最明显。mapk通路抑制剂处理星形胶质细胞后,通过荧光定量pcr和westernblot检测cox-1和cox-2的表达水平。结果显示,sb203580和u0126能够下调cox-1的mrna和蛋白的表达,sp600125对星形胶质细胞cox-1无影响;sb203580、sp600125和u0126处理星形胶质细胞后均能显著下调cox-2的mrna和蛋白的表达水平,其中u0126的抑制效果最明显。该结果结合上述pge2的表达变化表明,gnrh通过p38/erk-cox-1和p38/jnk/erk-cox-2信号通路促进星形胶质细胞pge2的产生,且p38/jnk/erk-cox-2途径在产生pge2的过程中起更重要的作用。综上所述,该实验可以得到以下结论:(1)体外培养的星形胶质细胞能够表达gnrhr,为研究gnrh调节星形胶质细胞功能奠定了形态学依据。(2)GnRH影响星形胶质细胞PGE2的表达,较高浓度(10-8 mol/L、10-6 mol/L)时抑制细胞PGE2的产生,较低浓度(10-10 mol/L)时对PGE2的表达具显著促进作用。(3)GnRH刺激星形胶质细胞能够通过上调COX-1和COX-2促进PGE2的产生。且在该过程中COX-2起主要作用。(4)GnRH可通过p38/ERK-COX-1和p38/JNK/ERK-COX-2信号通路促进星形胶质细胞PGE2的产生,且p38/JNK/ERK-COX-2途径在产生PGE2的过程中起更重要的作用。