反-10顺-12共轭亚油酸被认为是高精日粮下乳脂降低的主要原因,但其抑制乳脂合成的明确的分子机制尚不清晰。本研究采用组织块法体外培养牛乳腺上皮细胞,并用相应的技术手段对该细胞进行鉴定,后续试验以该乳腺上皮细胞为模型,研究反-10顺-12共轭亚油酸对乳脂合成的影响及机理。本研究共分为四个试验。试验一,乳腺上皮细胞的体外培养及鉴定。细胞培养过程可分为如下步骤：用无菌器材取健康、泌乳奶牛乳腺组织,将剪至乳糜状且清洗干净的组织接种于培养瓶底,37℃,5% CO2培养箱中培养,隔天换液,待有单层细胞铺满瓶底时,使用胰酶纯化,获得较为纯化的乳腺上皮细胞并传代培养。倒置相差显微镜观察乳腺上皮细胞培养过程,比较上皮细胞与成纤维细胞形态学差异。显微拍照结果显示：上皮细胞呈现椭圆形或多边形,成纤维细胞呈现细长纤维状或多角型；传代培养的后期,由于接触抑制等原因细胞出现凋亡和脱落。血细胞记数板对乳腺上皮细胞进行记数,绘制乳腺上皮细胞生长曲线,确定其生长周期的生物学特性。生长曲线呈明显的“S”形,符合体外培养的细胞的生长特性。免疫细胞化学方法鉴定上皮细胞的骨架蛋白——CK18,免疫反应呈阳性,证明该组织块来源的细胞为乳腺上皮细胞。对酪蛋白mRNA的PCR产物进行电泳,条带清晰,证明该乳腺细胞能在mRNA水平表达酪蛋白。WB结果显示,该乳腺上皮细胞能在蛋白质水平表达酪蛋白。油红染色和透射电镜超微结构观察显示：该体系下培养的乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳脂的功能。综上结果表明,该体系下培养的乳腺上皮细胞具有良好的体外生长状况,能在体外条件下合成乳蛋白和乳脂,具备功能性研究的条件,适合作为本研究的模型细胞。试验二,研究不同浓度梯度的t10c12 CLA对奶牛乳腺上皮细胞的毒性。将细胞分为以下九个梯度处理：0μM,37.5μM,75μM,112.5μM,150 u M,187.5 u M,225μM,262.5μM,300μM t10c12 CLA。MTT法测定细胞成活率,确定无毒添加剂量,试验结果表明150μM t10c12 CLA之后的添加量均显著抑制了细胞的生长,且300 u M的剂量已接近半数致死量。所以,后续试验中t10c12 CLA添加量最大不可超过150μM。试验三,研究t10c12 CLA对乳脂合成的影响。试验从宏观和微观角度确定t10c12CLA对乳脂合成的影响。本试验第一部分,分为如下五个处理OμM,37.5μM,75 u M,112.5 u M,150 u Mt10c12 CLA,试剂盒法测其胞浆甘油三酯的浓度,结果表明75μM,112.5μM,150μM t10c12 CLA能显著降低了胞浆甘油三酯的含量(P≤0.05),其余浓度与对照组相比,胞浆甘油三酯的含量无显著变化(P≥0.05)。且150μMt10c12 CLA对乳脂的抑制程度接近高精日粮条件乳脂的降低程度。因此,将150 u M t10c12 CLA作为后续试验的处理浓度。第二部分,分析脂肪酸组成结果表明,150 u Mt10c12 CLA显著降低了UFA和MSCFA比例(P<0.0001),PUFA比例无显著变化(P=0.3471)。T10c12 CLA组DGAT2(P=0.0198)和ACSL(P=0.0319)表达丰度显著增加。AGPAT(P=0.01724)和DGAT1(P=0.1449),变化不显著。脂肪酸合成基因FAS(P=0.017)、SCD (P=0.0496)、ACC(P=0.0021)显著降低。试验四,T10c12 CLA抑制乳脂合成的分子机制的探索。SREBP-1是脂类合成相关基因的上游调节元件。荧光定量PCR结果表明,150μMt10c12 CLA对SREBP-1基因表达和蛋白质加工相关因子的基因表达均无显著影响(P≥0.05)。WB结果表明150 u Mt10c12 CLA对pSEBP-1表达无显著影响,但是降低了nSREBP-1的表达,其主要机理可能是t10c12 CLA影响了nSREBP-1的降解。结论：成功在体外条件下培养了功能性牛乳腺上皮细,t10c12 CLA的添加量为150μM时能抑制脂肪酸的从头合成,从而降低甘油三酯的含量,对甘油三酯合成的基因表达有促进作用,但显著下调了脂肪酸合成基因的表达,其机理是降低了乳脂合成上游调节元件SREBP-1的活性蛋白的含量。