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背景及目的人脑胶质瘤(Glioma)是中枢神经系统原发恶性肿瘤,胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)是WHO Ⅳ级胶质瘤,具有高生长速率和高侵袭性,患者预后极差。目前治疗方案主要为手术结合放化疗,当前迫切需要新的分子治疗靶点为靶向治疗研发提供帮助。表观遗传修饰N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine,m6A)调控着RNA行使功能以及代谢中的多个环节。这些过程主要依赖m6A甲基转移酶(“writers”)、去甲基化酶(“eraser”)和甲基化阅读蛋白(“readers”)等。脂肪组织和肥胖相关蛋白(Fatmass and obesity-associated protein,FTO)是第一个被确认的m6A去甲基化酶,探究FTO在胶质瘤进展过程中发挥的作用,有助于我们深入理解胶质瘤的发病机制,寻找新的分子治疗靶点。本文的第一部分探究FTO在各级别胶质瘤组织内的表达特点,并阐明FTO对于胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移发挥的作用;第二部分探究FTO作用于miR-10a-5p的初级转录产物pri-miR-10a剪切成熟的具体过程;第三部分揭示调控FTO表达的转录因子SPI1在各级别胶质瘤组织内的表达量和患者生存期之间的关系,并阐明DB2313转化应用于治疗GBM的潜力。材料和方法(1)使用以下方法探究胶质瘤组织内FTO的表达特点使用IHC、Western Blot检测不同级别胶质瘤手术样本中FTO的水平。以生物信息学分析的方式探究FTO在公共数据库内的表达量特点,分析FTO表达量与患者临床特征之间的关系。(2)体外和体内实验探究FTO对胶质瘤细胞恶性行为的影响使用过表达或敲低FTO的慢病毒感染胶质母细胞瘤细胞系,构建稳定过表达或敲低FTO的肿瘤细胞系。使用CCK-8、EdU、Transwell实验探究FTO对胶质瘤细胞增殖、侵袭迁移能力的影响。裸鼠原位种瘤手术构建肿瘤动物模型,以荧光成像仪检测裸鼠颅内肿瘤生长的状态,并记录裸鼠生存期。(3)RT-qPCR方法检测miRNA表达量比对miRNA测序数据和已有的研究中受m6A和甲基化阅读蛋白HNRNPA2B1共同影响的miRNA数据集,寻找下游差异表达miRNA。使用RT-qPCR探究FTO对pri-miR-10a和成熟体miR-10a-5p的表达的影响。(4)免疫共沉淀探究蛋白互作关系通过Co-IP实验探究FTO的过表达或敲低对HNRNPA2B1和DGCR8之间相互作用的影响。通过MeRIP实验探究pri-miR-10a上的m6A甲基化位点。(5)构建突变位点序列将野生型pri-miR-10a上“GAACU”替换为“GATCU”,整合到荧光素酶报告基因质粒,行双荧光素酶报告基因实验,探究HNRNPA2B1对pri-miR-10a剪切成熟的影响。(6)使用以下方法预测调控FTO转录的转录因子,探究其功能使用hTFtarget数据库预测调控FTO表达的转录因子,使用Jaspar数据库预测FTO启动子区域与转录因子结合的位点。向细胞系转染SPI1的小干扰,通过Westernblot实验检测相关蛋白指标的变化情况。通过CHIP实验和双荧光素酶报告基因实验确定SPI1与启动子之间的调控关系。(7)裸鼠皮下种瘤后给药,探究DB2313的抑癌作用使用U87MG细胞系进行裸鼠皮下种瘤,分为给药组和对照组,腹腔注射DB2313以及对照溶剂,观察肿瘤生长大小并进行统计分析。结果(1)FTO抑制胶质瘤细胞系的增殖、侵袭和迁移,低表达FTO提示较差的临床预后分析TCGA、CGGA等肿瘤数据库的FTO表达量数据得出,随胶质瘤级别升高,FTO的表达量下降,且在间充质型胶质母细胞瘤中FTO的表达量低于前神经元型和经典型。临床样本的免疫组化及Western blot实验表现出一致的结果。低表达FTO的患者有较短的生存期。通过在肿瘤细胞系内过表达或敲低FTO,并进行CCK-8、EdU、Transwell和3D肿瘤球侵袭实验发现,FTO抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、侵袭迁移等过程。裸鼠颅内种瘤实验提示,过表达FTO抑制了胶质瘤细胞系的生长。(2)Pri-miR-10a剪切成熟的过程受到m6A修饰的调控,且FTO抑制miR-10a-5p的生成PCR实验表明,过表达FTO能够抑制成熟体miR-10a-5p的表达并使初级转录产物pri-miR-10a的表达量升高。RIP实验显示,HNRNPA2B1能与pri-miR-10a相互结合。HNRNPA2B1的Co-IP实验能够提示其与DGCR8互相结合,且FTO的过表达能够抑制其相互作用。位点突变的双荧光素酶报告基因实验提示,突变抑制pri-miR-10a剪切成熟的过程。CCK-8,Transwell挽救实验显示,miR-10a-5p的mimics能够挽救由FTO过表达所造成的胶质母细胞瘤细胞的增殖、侵袭迁移能力的抑制。MTMR3是miR-10a-5p的下游靶点,Western blot实验得出,miR-10a-5p的mimics能够挽救由FTO过表达导致的MTMR3蛋白水平的上调。(3)SPI1通过抑制FTO增强胶质瘤细胞增殖、侵袭迁移能力在线数据库预测得出,调控FTO的转录因子中,SPI1在脑组织具有较高的富集得分,SPI1与FTO启动子区域“GGAA”位点相结合。敲低SPI1,抑制了 U118MG和U87MG细胞系的迁移、增殖、侵袭能力。CHIP、dual-luciferasereporter实验提示,SPI1能够结合到FTO启动子区域,并抑制其转录。Western blot实验表明,胶质瘤细胞系经过SPI1特异性抑制剂DB2313处理后,FTO和MTMR3表达量升高,且CD44和PCNA表达量下降。CCK-8和Transwell实验表明,DB2313抑制了胶质瘤细胞的增殖和侵袭迁移。裸鼠皮下种瘤后,给予DB2313腹腔注射治疗,相比于对照组,治疗组肿瘤的生长受到抑制。结论(1)FTO的表达量随胶质瘤级别升高而降低,且低表达FTO与较差临床预后相关,FTO具有成为判断胶质瘤患者预后的分子标志物的潜力。FTO抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、侵袭迁移。(2)pri-miR-10a剪切成熟过程受到m6A的调控,且m6A甲基化识别酶HNRNPA2B1参与该过程。FTO抑制miR-10a-5p的生成,在胶质母细胞瘤中FTO以miR-10a-5p/MTMR3通路发挥抑癌作用。(3)SPI1通过靶向结合于FTO启动子区域,抑制FTO的转录,导致其低表达。SPI1靶向药物DB2313可逆转FTO的低表达进而抑制胶质瘤恶性进展。