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研究背景
胃癌，顾名思义就是发生在胃部的癌症，最初癌细胞起源于正常胃黏膜上皮，在发病患者中最常见的胃癌病理类型为腺癌。发病早期，患者常无任何明显症状，因此导致大部分患者确诊时已进展到中晚期，并且常伴有远处转移，错过早期治疗机会而导致预后差。幽门螺旋杆菌的是国际公认的Ⅰ类致癌物，在胃癌的发生发展过程中具有重要作用，因此，找到幽门螺旋杆菌相关胃癌发生发展的作用机制，对幽门螺旋杆菌相关胃癌的早期诊断和治疗具有重要临床价值。
整合素是普遍存在于脊椎动物表面，依赖于Ca2+或Mg2+的细胞黏附分子。整合素在肿瘤的形成过程具有重要作用，除了调节细胞与细胞外基质的粘附外，还可影响肿瘤细胞的一系列生物学行为，提示其可能作为肿瘤治疗的新靶点。截至目前整合素家族的很多亚型在多种肿瘤中都有研究报道，但在胃癌中作用尚不明确，我们通过全基因组测序，发现幽门螺旋杆菌显著诱导了胃癌细胞中ITGA3的表达，本研究旨在验证ITGA3在胃癌细胞中发挥的生物学功能及其促进幽门螺旋杆菌相关胃癌进展的具体作用机制。
研究目的
探讨幽门螺旋杆菌感染胃癌细胞中ITGA3的表达是否较对照组升高，体内外实验进一步验证ITGA3在胃癌的恶性进展中的作用及其分子机制，以寻找胃癌早期诊断和治疗的潜在靶点。
研究方法
1.胃癌细胞及组织中ITGA3的表达及临床意义。
将幽门螺旋杆菌与胃癌细胞共培养后，用高通量测序的方法筛选差异表达的mRNA，筛选标准为倍数改变≥2，P＜0.05。免疫组化技术检测80例胃炎到胃癌转化过程中临床组织标本中ITGA3表达的变化。生物信息学方法初步研究ITGA3在胃癌中的作用，GEPIA分析TCGA数据库中胃癌组织中较正常组织ITGA3的表达差异，Kaplan-Meier曲线评价预后，发现ITGA3表达水平与胃癌患者预后的相关性。GSEA分析富集胃癌中ITGA3表达相关通路，初步揭示其可能的作用机制。
2.研究幽门螺旋杆菌感染对胃癌细胞和胃炎组织中ITGA3表达的诱导作用。
幽门螺旋杆菌标准菌株与选取的胃癌细胞和正常胃上皮细胞共培养，检测ITGA3表达的变化;通过幽门螺旋杆菌灌胃建立小鼠胃炎模型，体内实验验证幽门螺旋杆菌对ITGA3表达的影响。
3.体内外实验研究胃癌细胞中ITGA3的表达水平对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。
采用慢病毒转染的方法构建ITGA3过表达及敲除的细胞系，联合幽门螺旋杆菌共培养，CCK8、EdU、克隆形成、Transwell、划痕等功能实验，检测ITGA3的表达量与胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的相关性，用分子生物学实验Westernblot检测ITGA3过表达以及联合幽门螺旋杆菌共培养之后，对增殖、凋亡相关分子蛋白表达的影响。裸鼠皮下注射对照组及高表达ITGA3的胃癌细胞系，检测ITGA3表达量对肿瘤生长的影响。
4.ITGA3在胃癌进程中作用的分子机制。
检测ITGA3表达水平改变，对NF-KB，mTOR表达的影响。利用裸鼠成瘤组织标本和幽门螺旋杆菌感染小鼠胃炎组织标本，体内验证ITGA3/NF-KB/mTOR通路的激活。
研究结果
1.胃癌细胞及组织中ITGA3的表达及临床意义。
mRNA高通量芯片筛选，发现ITGA3是幽门螺旋杆菌诱导后显著上调的基因之一。对80例胃炎到胃癌转化过程中不同阶段患者组织进行免疫组化染色，结果发现幽门螺旋杆菌阳性胃炎和胃癌组织黏膜与幽门螺旋杆菌阴性胃炎和胃癌组织黏膜相比，ITGA3的表达量明显增强，差异有统计学意义。生物信息学分析显示ITGA3在胃癌组织中较癌旁组织表达高，Kaplan-Meierplotter分析表明ITGA3高表达的胃癌患者预后更差。GSEA富集分析表明凋亡信号通路、幽门螺旋杆菌感染信号通路在ITGA3高表达表型中差异富集。
2.幽门螺旋杆菌感染可诱导胃癌细胞和正常胃上皮细胞ITGA3的表达。
将胃癌细胞MKN45，MGC803，HGC27与正常胃黏膜细胞GES1与幽门螺旋杆菌共培养，8小时后分别提取RNA和蛋白质，通过PCR分析和Westernblot发现共培养后ITGA3的RNA和蛋白质水平均升高，结果有统计学意义。通过幽门螺旋杆菌灌胃的方法诱导小鼠胃粘膜发生慢性炎症，免疫组化分析ITGA3表达变化。结果表明，与幽门螺旋杆菌阴性的小鼠胃粘膜相比，幽门螺旋杆菌阳性的小鼠胃炎胃黏膜中ITGA3表达量显著升高。
3.体内外实验研究胃癌细胞中ITGA3的表达水平对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。
本底实验筛选ITGA3高低表达的胃癌细胞系，结果表明ITGA3在胃癌细胞MKN45中低表达，MGC803中高表达。通过慢病毒载体构建稳定的MKN45ITGA3以及MGC803shITGA3细胞系。与幽门螺旋杆菌共培养8小时后进行增殖，侵袭和迁移相关实验。实验结果表明，ITGA3过表达后，可以进一步促进幽门螺旋杆菌对胃癌细胞的增殖，侵袭和迁移能力的影响。而shITGA3组抑制部分幽门螺旋杆菌对胃癌细胞的增殖，侵袭和迁移能力的促进作用。
Westernblot显示过表达ITGA3和与幽门螺旋杆菌共培养均可增强增殖相关蛋白分子(Bcl-2，Survivin)的表达，降低凋亡相关分子(Bax)的表达，联合作用后促进增殖的作用将进一步加强。
裸鼠皮下注射MKN45过表达ITGA3的细胞，观察到注射MKN45过表达ITGA3细胞组的裸鼠肿瘤体积较对照组大，裸鼠体重较对照组下降快。
4.ITGA3激活了胃癌细胞中NF-KB/mTOR通路。
我们利用MKN45ITGA3过表达细胞系，以及MGC803shITGA3细胞系，分析下游相关信号通路分子的变化。实验结果表明，过表达ITGA3后，NF-KB，mTOR表达随之上调;抑制ITGA3表达后，结果随之相反。Westernblot结果表明过表达ITGA3的小鼠组织中，NF-KB和mTOR的表达水平上调，与体外实验结果一致。我们在小鼠幽门螺旋杆菌阳性胃粘膜组织中进一步验证幽门螺旋杆菌对ITGA3/NF-KB/mTOR通路的激活作用。
研究结论
幽门螺旋杆菌感染可诱导胃癌细胞ITGA3表达升高，与预后不良相关。ITGA3表达升高可进一步增强幽门螺旋杆菌对胃癌细胞的增殖，侵袭和迁移能力的促进作用。ITGA3激活了胃癌细胞中NF-KB/mTOR通路，促进了胃癌的恶性进程。
胃癌，顾名思义就是发生在胃部的癌症，最初癌细胞起源于正常胃黏膜上皮，在发病患者中最常见的胃癌病理类型为腺癌。发病早期，患者常无任何明显症状，因此导致大部分患者确诊时已进展到中晚期，并且常伴有远处转移，错过早期治疗机会而导致预后差。幽门螺旋杆菌的是国际公认的Ⅰ类致癌物，在胃癌的发生发展过程中具有重要作用，因此，找到幽门螺旋杆菌相关胃癌发生发展的作用机制，对幽门螺旋杆菌相关胃癌的早期诊断和治疗具有重要临床价值。
整合素是普遍存在于脊椎动物表面，依赖于Ca2+或Mg2+的细胞黏附分子。整合素在肿瘤的形成过程具有重要作用，除了调节细胞与细胞外基质的粘附外，还可影响肿瘤细胞的一系列生物学行为，提示其可能作为肿瘤治疗的新靶点。截至目前整合素家族的很多亚型在多种肿瘤中都有研究报道，但在胃癌中作用尚不明确，我们通过全基因组测序，发现幽门螺旋杆菌显著诱导了胃癌细胞中ITGA3的表达，本研究旨在验证ITGA3在胃癌细胞中发挥的生物学功能及其促进幽门螺旋杆菌相关胃癌进展的具体作用机制。
研究目的
探讨幽门螺旋杆菌感染胃癌细胞中ITGA3的表达是否较对照组升高，体内外实验进一步验证ITGA3在胃癌的恶性进展中的作用及其分子机制，以寻找胃癌早期诊断和治疗的潜在靶点。
研究方法
1.胃癌细胞及组织中ITGA3的表达及临床意义。
将幽门螺旋杆菌与胃癌细胞共培养后，用高通量测序的方法筛选差异表达的mRNA，筛选标准为倍数改变≥2，P＜0.05。免疫组化技术检测80例胃炎到胃癌转化过程中临床组织标本中ITGA3表达的变化。生物信息学方法初步研究ITGA3在胃癌中的作用，GEPIA分析TCGA数据库中胃癌组织中较正常组织ITGA3的表达差异，Kaplan-Meier曲线评价预后，发现ITGA3表达水平与胃癌患者预后的相关性。GSEA分析富集胃癌中ITGA3表达相关通路，初步揭示其可能的作用机制。
2.研究幽门螺旋杆菌感染对胃癌细胞和胃炎组织中ITGA3表达的诱导作用。
幽门螺旋杆菌标准菌株与选取的胃癌细胞和正常胃上皮细胞共培养，检测ITGA3表达的变化;通过幽门螺旋杆菌灌胃建立小鼠胃炎模型，体内实验验证幽门螺旋杆菌对ITGA3表达的影响。
3.体内外实验研究胃癌细胞中ITGA3的表达水平对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。
采用慢病毒转染的方法构建ITGA3过表达及敲除的细胞系，联合幽门螺旋杆菌共培养，CCK8、EdU、克隆形成、Transwell、划痕等功能实验，检测ITGA3的表达量与胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的相关性，用分子生物学实验Westernblot检测ITGA3过表达以及联合幽门螺旋杆菌共培养之后，对增殖、凋亡相关分子蛋白表达的影响。裸鼠皮下注射对照组及高表达ITGA3的胃癌细胞系，检测ITGA3表达量对肿瘤生长的影响。
4.ITGA3在胃癌进程中作用的分子机制。
检测ITGA3表达水平改变，对NF-KB，mTOR表达的影响。利用裸鼠成瘤组织标本和幽门螺旋杆菌感染小鼠胃炎组织标本，体内验证ITGA3/NF-KB/mTOR通路的激活。
研究结果
1.胃癌细胞及组织中ITGA3的表达及临床意义。
mRNA高通量芯片筛选，发现ITGA3是幽门螺旋杆菌诱导后显著上调的基因之一。对80例胃炎到胃癌转化过程中不同阶段患者组织进行免疫组化染色，结果发现幽门螺旋杆菌阳性胃炎和胃癌组织黏膜与幽门螺旋杆菌阴性胃炎和胃癌组织黏膜相比，ITGA3的表达量明显增强，差异有统计学意义。生物信息学分析显示ITGA3在胃癌组织中较癌旁组织表达高，Kaplan-Meierplotter分析表明ITGA3高表达的胃癌患者预后更差。GSEA富集分析表明凋亡信号通路、幽门螺旋杆菌感染信号通路在ITGA3高表达表型中差异富集。
2.幽门螺旋杆菌感染可诱导胃癌细胞和正常胃上皮细胞ITGA3的表达。
将胃癌细胞MKN45，MGC803，HGC27与正常胃黏膜细胞GES1与幽门螺旋杆菌共培养，8小时后分别提取RNA和蛋白质，通过PCR分析和Westernblot发现共培养后ITGA3的RNA和蛋白质水平均升高，结果有统计学意义。通过幽门螺旋杆菌灌胃的方法诱导小鼠胃粘膜发生慢性炎症，免疫组化分析ITGA3表达变化。结果表明，与幽门螺旋杆菌阴性的小鼠胃粘膜相比，幽门螺旋杆菌阳性的小鼠胃炎胃黏膜中ITGA3表达量显著升高。
3.体内外实验研究胃癌细胞中ITGA3的表达水平对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。
本底实验筛选ITGA3高低表达的胃癌细胞系，结果表明ITGA3在胃癌细胞MKN45中低表达，MGC803中高表达。通过慢病毒载体构建稳定的MKN45ITGA3以及MGC803shITGA3细胞系。与幽门螺旋杆菌共培养8小时后进行增殖，侵袭和迁移相关实验。实验结果表明，ITGA3过表达后，可以进一步促进幽门螺旋杆菌对胃癌细胞的增殖，侵袭和迁移能力的影响。而shITGA3组抑制部分幽门螺旋杆菌对胃癌细胞的增殖，侵袭和迁移能力的促进作用。
Westernblot显示过表达ITGA3和与幽门螺旋杆菌共培养均可增强增殖相关蛋白分子(Bcl-2，Survivin)的表达，降低凋亡相关分子(Bax)的表达，联合作用后促进增殖的作用将进一步加强。
裸鼠皮下注射MKN45过表达ITGA3的细胞，观察到注射MKN45过表达ITGA3细胞组的裸鼠肿瘤体积较对照组大，裸鼠体重较对照组下降快。
4.ITGA3激活了胃癌细胞中NF-KB/mTOR通路。
我们利用MKN45ITGA3过表达细胞系，以及MGC803shITGA3细胞系，分析下游相关信号通路分子的变化。实验结果表明，过表达ITGA3后，NF-KB，mTOR表达随之上调;抑制ITGA3表达后，结果随之相反。Westernblot结果表明过表达ITGA3的小鼠组织中，NF-KB和mTOR的表达水平上调，与体外实验结果一致。我们在小鼠幽门螺旋杆菌阳性胃粘膜组织中进一步验证幽门螺旋杆菌对ITGA3/NF-KB/mTOR通路的激活作用。
研究结论
幽门螺旋杆菌感染可诱导胃癌细胞ITGA3表达升高，与预后不良相关。ITGA3表达升高可进一步增强幽门螺旋杆菌对胃癌细胞的增殖，侵袭和迁移能力的促进作用。ITGA3激活了胃癌细胞中NF-KB/mTOR通路，促进了胃癌的恶性进程。