黄瓜(Cucumis sativus L.)是重要的设施蔬菜之一,也是典型的冷敏植物。在早春和秋冬季节,低温是产量和质量的限制因子,因此,黄瓜耐冷性的提高成为周年供应的一个关键环节,通过育种和栽培的综合手段克服黄瓜生产中的低温障碍是解决这个问题的主要手段,也是设施黄瓜的研究热点,而正确理解黄瓜的耐冷机制是耐冷育种和栽培的良好基础。为探明黄瓜耐低温胁迫的生理和分子生物学机制,本文以(8-15℃)亚适宜低温为胁迫因子,应用植物生理学、生物化学、分子生物学及功能基因分析的手段,研究低温影响黄瓜生长的机理,探明参与抗逆调控的重要植物生长类物质多胺(PAs)和水杨酸(SA)调节黄瓜耐冷性的生理生化作用机制,克隆分析了黄瓜耐冷相关基因CsLDC。取得了以下主要研究结果：1.黄瓜赖氨酸脱羧酶(CsLDC)的全长cDNA序列克隆和冷胁迫过程中CsLDC基因表达的初步研究高质量的RNA是研究基因表达以及后续下游试验的关键,常规的Trizol法对于种子和果实这类器官来说,很难提到理想的RNA。通过对几种方法的比较研究,对尿素-氯化锂法进行了改良,结果表明：对种子这类多糖、多酚以及蛋白质含量高的器官,改良尿素-氯化锂法能够获取高质量RNA,其28S、18S和5S电泳带型清晰完整,A260/A280值在2.0-2.1之间,用其进行其反转录的cDNA,不仅可以用作RT-PCR、也可以用做AFLP、RACE(快速扩增cDNA末端)以及Real time-PCR等后续研究。此外,该方法同样可以用于葫芦科其它作物如丝瓜、南瓜及甜瓜的种子,以及叶片RNA的提取。根据本课题组已报道的长度为132bp黄瓜耐冷相关基因(ccrtl32)片段序列(逯明辉,2005),运用RACE技术技术,克隆了长度为1069bp的全长cDNA序列。该序列的有效开放阅读框共含648个核苷酸编码一个长为215个氨基酸残基的蛋白质。经比对该全长cDNA及其编码的蛋白质序列,与几个植物的赖氨酸脱羧酶基因有较高的同源性,因此对该基因命名为黄瓜赖氨酸脱羧酶(Cucumis sativus Lysine Decarboxylase, CsLDC)。CsLDC含有高度保守的赖氨酸脱羧酶结构域以及一个高度保守的基序PGGXGTXXE,经预测,CsLDC蛋白的三级结构和已经报道的拟南芥赖氨酸脱羧酶晶体结构高度相似,与拟南芥赖氨酸脱羧酶进化关系较近。用RT-PCR和荧光实时定量PCR技术研究两个耐冷性不同的黄瓜品种在冷胁迫过程中基因表达的结果表明,低温胁迫下,耐冷品种长春密刺的种子及幼叶中CsLDC基因均能被强烈诱导表达,但在冷敏品种北京截头中表达量较低,提示该基因与黄瓜的耐冷性有关。2.外源多胺(PAs)调节抗氧化酶增强黄瓜耐冷性的研究低温处理后1d,耐冷品种长春密刺叶片中Put、Spd、Spm被诱导生成,Put含量达到最大,随后呈下降趋势,但Spd和Spm含量却持续上升,其中Spd含量始终高于Put和Spm含量。北京截头叶片中,Put含量在低温处理后1d增加,随后缓慢下降,而Spd含量一直呈下降趋势,Spm含量变化不大。外源Put和Spd处理均能提高两个品种内源三种多胺含量,但是长春密刺叶片中内源Put、Spd、Spm整体高于北京截头,外源Spd对提高内源多胺含量的影响大于外源Put,多胺抑制剂丙酮双脒腙(MGBG)却能抑制两个品种叶片中Spd、Sp(?)n的产生,但是对冷敏品种的影响大于对耐冷品种的影响。低温降低了两个品种可溶性蛋白的含量、抗氧化酶SOD、POD、CAT和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,并影响细胞膜稳定性,但是对北京截头的影响大于长春密刺,这种影响可以通过外源Put和Spd而得到缓解,如减少了两个品种叶片由于冷害引起的电解质渗透和丙二醛含量,但是不同多胺种类所起作用因品种而异,多胺抑制剂MGBG预处理后可以抵消多胺(PAs)的作用。此外,组织化学染色和定量测定表明,应用外源Put和Spd可以消除或减少由低温胁迫引起的过氧化氢(H202)积累,而MGBG的作用刚好相反,这种情况在北京截头中尤为明显。值得注意的是,在低温胁迫下长春密刺叶片三种内源多胺含量均高于北京截头,低温处理前长春密刺和北京截头幼苗中SOD、POD和CAT活性没有明显差异,但低温处理整个过程前者APX始终高于后者。这些结果表明多胺(PAs)在黄瓜耐低温胁迫方面具有重要作用,而这种作用很有可能通过调节抗氧化系统而实现。3.水杨酸对低温胁迫黄瓜抗氧化系统和耐冷性的影响低温胁迫下两个品种叶片中内源SA含量明显高于种子,耐冷品种长春密刺的萌动种子和幼苗叶片内源SA含量均高于冷敏品种北京截头；长春密刺叶片中Pro和POD代谢水平高于冷敏品种北京截头,而MDA、电解质渗漏率和H202积累则低于北京截头,外源SA处理能显著提高低温胁迫条件下黄瓜叶片的POD活性及可溶性蛋白含量,降低MDA含量和电解质渗出率；相比北京截头来说,水杨酸对低温胁迫下长春密刺叶片中的H202积累具有更为明显的消除作用。结果提示品种间耐冷性不同导致了内源水杨酸代谢水平的差异,外源水杨酸可以提高黄瓜抵抗低温胁迫的能力,而且这种作用可能是通过调节体内的抗氧化系统来实现的。