Barry Marshall于1982年偶然发现幽门螺杆菌，2005年因此获得诺贝尔生理与医学奖。H.pylori可长期定植于胃粘膜，是胃炎、胃溃疡的主要致病因子，是胃癌的Ⅰ类致癌因子。我国H.pylori现症感染率在50％以上。由于抗生素的广泛使用，H.pylori容易产生耐药，不易被清除目前面临着H.pylori的严峻考验。　　目前H.pylori感染后的免疫应答研究主要集中于CD4T淋巴细胞，包括Th1、Th2、Treg、Th17等细胞亚型。虽然关于CD4T淋巴细胞免疫功能的报道较多，但仍然不能诠释H.pylori感染所致多种胃肠疾病的发病机理和抗感染保护的应答机制。H.pylori是一种革兰阴性菌，主要位于细胞外。但已有文献报道H.pylori可存在于上皮细胞、巨噬细胞等细胞中。在H.pylori感染中，CD8T淋巴细胞逐渐受到研究者的关注，有研究发现CD8T淋巴细胞在H.pylori感染患者中增加，Agnihotri N等检测分析内窥镜取的患者胃组织标本，发现在H.pylori阳性患者中CD4+/CD8+细胞比例降低，CD8T淋巴细胞数量增加。JosefA等发现CD8+T淋巴细胞可以被负载H.pylori抗原的B细胞或树突状细胞有效激活，引起特异性应答。这提示:H.pylori感染可引起CD8+T淋巴细胞的应答反应。但有关H.pylori感染CD8T淋巴细胞的研究报道甚少，尤其是针对胃粘膜局部的CD8T淋巴细胞的免疫学特征与功能的研究尚处于空白。因此，本课题基于H.pylori感染的小鼠模型，从感染部位入手对胃粘膜局部CD8T淋巴细胞的应答特点、表型特征以及免疫学功能等进行了深入研究。　　目的:　　以H.pylori感染小鼠为动物模型，深入探索胃粘膜CD8T淋巴细胞的表型特征、应答规律及其在H.pylori感染中的免疫学功能作用，将为深刻剖析H.pylori感染过程中胃粘膜CD8T淋巴细胞的免疫学特征与作用提供新的认识，为全面解释H.pylori感染所致多种胃肠疾病的发病机理提供新的线索，有助于揭示CD8T淋巴细胞在H.pylori感染中的免疫作用与应答机制，为H.pylori感染的免疫预防与治疗提供理论依据。　　方法:　　1、采用小鼠胃粘膜单细胞悬液制备技术、细胞内因子染色方法和流式细胞术，检测分析H.pylori感染和未感染小鼠胃粘膜局部CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞的相对比例与绝对数量、表型特征分子、趋化因子受体以及主要细胞因子分泌水平等免疫学指标，以研究H.pylori感染后小鼠胃粘膜CD8T淋巴细胞的应答规律与表型特征。　　2、采用胃组织直接免疫荧光染色，激光共聚焦下拍片，检测H.pylori感染和未感染小鼠胃粘膜CD8T淋巴细胞数量及主要分布，以便更直观的观察胃粘膜CD8T淋巴细胞的数量和分布特点。　　3、采用anti-CD3/anti-CD28非特异性刺激小鼠胃粘膜CD8T淋巴细胞，脾淋巴细胞体外特异性扩增培养技术及细胞因子染色方法，检测非特异性刺激和特异性刺激下，CD8T淋巴细胞的细胞因子水平，以探究H.pylori感染是否可诱导CD8T淋巴细胞产生非特异性和特异性应答。　　4、采用CD8基因敲除小鼠模型，通过胃粘膜组织DNA提取技术，Real-time PCR以及胃粘膜HE染色等方法，检测小鼠胃粘膜H.pylori定植量，并进行病理评分，以研究CD8T淋巴细胞在H.pylori感染中的免疫保护和炎性损伤作用。　　5、通过蛋白芯片检测技术，测定小鼠胃粘膜25种趋化因子的表达情况，探究H.pylori感染小鼠和未感染小鼠胃粘膜趋化因子表达差异。　　6、胃上皮细胞株(AGS)与H.pylori共培养技术、ELISA和蛋白芯片分析技术，检测培养上清中趋化因子的分泌水平，以研究在H.pylori刺激下，胃上皮细胞分泌趋化因子的水平和特征。　　7、通过Transwell实验和趋化因子受体阻断实验，检测6种表达增强的趋化因子对CD8T淋巴细胞的趋化作用，以分析CD8T淋巴细胞向胃粘膜募集的趋化机制。　　结果:　　1、H.pylori感染小鼠胃粘膜CD8T淋巴细胞的比例（6.99％±1.24％）和绝对数34125均明显增加，显著高于对照组小鼠（4.01％±0.85％，14457），(P＜0.01)。此外，感染小鼠胃粘膜中CD8T淋巴细胞的比例和绝对数量也显著高于CD4T淋巴细胞(P＜0.01)。　　2、胃粘膜免疫荧光结果显示:H.pylori感染组小鼠胃粘膜CD8T淋巴细胞数量显著高于未感染对照组，且CD8T淋巴细胞主要分布于粘膜下层。　　3、H.pylori感染小鼠后不同时间点（2周、4周、8周）监测结果显示:感染2周时小鼠胃粘膜CD8T淋巴细胞比例显著增加，在第4周时达到峰值(8.0％±1.37％)，第8周时出现下降。　　4、H.pylori感染小鼠胃粘膜CD8T淋巴细胞经CD3/CD28抗体非特异性刺激后，可分泌高水平IFN-r、GraB，显著高于未感染小鼠(P＜0.05，P＜0.01)，TNF-a、IL-17和Perforin水平与未感染小鼠无统计学差异。同时，感染小鼠脾淋巴细胞经体外特异性扩增后，在H.pylori全菌抗原刺激下，CD8T淋巴细胞可产生高水平IFN-r应答，显著高于未刺激组和未感染小鼠。　　5、H.pylori感染CD8敲除小鼠试验结果显示:敲除小鼠胃粘膜H.pylori定植量显著高于野生型感染小鼠(P＜0.01)，且敲除小鼠的炎症评分也明显高于野生型感染小鼠(P＜0.01)，上述结果表明:CD8T淋巴细胞可能发挥抗H.pylori定植和抗炎症损伤的免疫保护作用。　　6、胃粘膜CD8T淋巴细胞的免疫记忆表型检测显示:H.pylori感染小鼠胃粘膜CD8T淋巴细胞高表达CD44(99.3％)、CD69(87％)、CD103(89.7％)，低表达CD62L(2.4％)、CCR7(1.2％)。结果提示，胃黏膜CD8T淋巴细胞主要为常驻记忆型T细胞，即Trm细胞（CD103+、CCR7-、CD69+）。　　7、趋化因子受体的流式检测结果显示:H.pylori感染小鼠后胃粘膜CD8T淋巴细胞表面的CCR3(P＜0.05)、CCR4(P＜0.05)、CCR5(P＜0.01)和CXCR3(P＜0.01)等趋化因子受体表达显著高于未感染小鼠，其中CXCR3表达水平最高，约60％。　　8、小鼠胃粘膜组织趋化因子蛋白芯片分析发现，在待检的25种趋化因子中，感染组小鼠有6种趋化因子(CXCL11、CCL5、CCL12、CCL22、CXCL2、CXCL13)表达水平显著高于未感染组小鼠(P＜0.05)。此外，H.pylori与胃上皮细胞株(AGS)共培养后，ELISA检测上清发现AGS可分泌趋化因子CXCL11，与对照组相比具有显著统计学差异(P＜0.05)。　　9、趋化因子Traswell实验发现:CXCL11对CD8T淋巴细胞有明显的趋化作用，趋化指数达5，CCL5、CXCL13的趋化作用不是很明显，趋化指数在1.5左右，而CCL12、CCL22、CXCL2则几乎没有趋化作用。用抗体阻断CD8T淋巴细胞表达的趋化因子受体CXCR3后，CXCL11的趋化作用明显降低，表明CD8T淋巴细胞可通过CXCL11-CXCR3途径进行趋化并募集到达胃粘膜组织。　　结论:　　H.pylori感染小鼠后可引起胃粘膜CD8T淋巴细胞数量明显增加，主要为常驻记忆型T淋巴细胞(Trm)表型，可分泌细胞因子IFN-r和GraB进行应答;CD8T淋巴细胞可通过CXCL11-CXCR3途径向胃粘膜组织趋化募集，进而在H.pylori感染过程中发挥抗细菌定植和炎症损伤的免疫保护作用。揭示了胃粘膜CD8T淋巴细胞的表型特征、应答特点及功能作用。从一个新的角度认识H.pylori感染引起的免疫应答和炎症反应。