α-羟基酸是各种精细化学品的重要合成子,参与各种药物和体内可降解生物材料的合成,也是α-氨基酸的天然结构类似物,参与生物体内重要的生理活动,还是护肤化妆品中有效的活性添加剂。D-乳酸脱氢酶能够立体选择性催化D-α-羟基酸的合成,是一种有价值的催化剂,具有潜在的工业价值,广泛应用于食品、医药、化工等领域。本课题组前期研究中,从发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）JN248中获得了一个新型的对苯丙酮酸具有还原活力的D-乳酸脱氢酶（LF-d-LDH0653）,其最适底物为丙酮酸。本研究为了提高D-乳酸脱氢酶对芳香族等具有较大体积侧链的α-酮酸的催化活性,合成更多有价值的α-羟基酸,通过分子克隆技术和定向改造策略,获得了催化效率显著提高的突变体,并对相关的底物特异性和突变体酶学性质进行了研究。主要研究成果如下:（1）通过Alpha Fold2预测了LF-d-LDH0653的蛋白结构并进行分子对接。基于D-乳酸脱氢酶的结构和相关催化机制,分析发现LF-d-LDH0653活性中心有一团由Tyr102、Met309、Tyr53、Phe300和Trp136残基组成的包裹簇,其中Tyr102、Met309在同家族蛋白中高度保守。选择Tyr53、Phe300和Trp136三个残基作为候选突变位点。（2）成功构建了Tyr53、Phe300和Trp136三个位点的饱和突变体库。本研究共得到了64个变体,Phe300、Trp136的突变体和组合突变体活性普遍降低甚至完全失活,仅Tyr53突变后产生了有益突变,其中Y53A、Y53M、Y53L的相对酶活分别是野生型的133%、112%、109%。对Tyr53饱和突变体库进行底物谱测定,底物特异性变化和活性提高最显著的是Y53A。野生型对α-酮异己酸没有活性,但是Y53A突变体不仅对α-酮异己酸产生了较强的活性,而且对芳香族酮酸的酶活也有所提高。（3）对Y53A突变体进行酶学性质表征和分析。Y53A突变体的最适pH和温度为7.5和30℃,对α-酮异己酸的Michaelis-Menten常数（Km）、转换数(kcat)和催化效率(kcat/Km)分别为0.13 mM、112.60 s-1和856.67 mM-1·s-1。Y53A对苯丙酮酸的Km、kcat和kcat/Km分别为0.16 mM、78.17 s-1和481.62 mM-1·s-1,与野生型相比,催化效率提高了6.6倍。而且Y53A突变体对3,4-二羟基苯丙酮酸和对羟基苯丙酮酸的kcat/Km分别提高了7.5和12.7倍。结果表明,Tyr53是决定D-乳酸脱氢酶的底物特异性的关键位点,经定点突变可以影响其他各种底物的催化效率。