【摘 要】
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角蛋白酶（Keratinase）是一类可以特异性降解角蛋白的酶。在废弃物回收、皮革纺织和饲料添加等领域有着广泛的应用前景。然而,较低的胞外表达量仍是重组角蛋白酶开发的主要问题。因此,如何提高重组角蛋白酶的胞外表达量成为目前研究热点之一。本文以重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-p43NMK-Ker为研究对象,通过信号肽的筛选与理性设计、核糖体结合位点半理性设计、枯草芽孢
【基金项目】
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国家重点研发计划（2021YFC2104000）；
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角蛋白酶（Keratinase）是一类可以特异性降解角蛋白的酶。在废弃物回收、皮革纺织和饲料添加等领域有着广泛的应用前景。然而,较低的胞外表达量仍是重组角蛋白酶开发的主要问题。因此,如何提高重组角蛋白酶的胞外表达量成为目前研究热点之一。本文以重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-p43NMK-Ker为研究对象,通过信号肽的筛选与理性设计、核糖体结合位点半理性设计、枯草芽孢杆菌分泌系统改造,提高了角蛋白酶的胞外表达量。主要研究内容如下:（1）基于信号肽数据库检索、分泌途径和亚细胞定位的预测,建立了包含20条枯草芽孢杆菌B.subtilis strain 168内源的信号肽文库,替换初始信号肽并测试其对角蛋白酶胞外表达量的影响。获得10株胞外分泌能力提高的重组菌株,其中含有SPdacB的重组菌株角蛋白酶胞外酶活力达到84.3 KU×m L-1,比酶活为182.0 U×μg-1,分别为出发菌株的8.1倍和5.0倍。（2）基于信号肽结构、序列及氨基酸性质分析对信号肽进行理性设计,通过信号肽定点突变和片段融合的方法提高了信号肽的胞外分泌能力。获得2株胞外分泌能力提高的菌株,其中WB600-p43NMK-Ker-SPbsn-T2K的胞外酶活力最高达到76.7 KU×m L-1,比酶活为167.9 U×μg-1。,相较WB600-p43NMK-Ker-SPbsn分别提高了48%和37%。（3）基于高通量筛选方法,通过突变位点半理性设计和饱和突变策略优化核糖体结合位点,提升m RNA翻译起始速率。获得2株角蛋白酶胞外酶活力提升的重组菌株,其中WB600-R16D12的胞外酶活力达到109.1 KU×m L-1,比酶活为221.2 U×μg-1,分别为出发菌株的10.5倍和6.4倍。（4）通过对枯草芽孢杆菌进行分泌系统改造提高其分泌能力。在基因组中插入相关分子伴侣编码基因的额外拷贝,包括跨膜辅助蛋白Sec A、Sec DF和后折叠辅助蛋白Prs A,并通过启动子优化调控其表达强度。此外,构建敲除了阻遏CIRCE调节子表达的阻遏物表达基因hrcA的重组菌株。将优化得到的重组质粒分别导入到上述重组菌株中,经发酵验证,重组菌株WB600-Prs A-P8-Ker,其胞外酶活力达到157.6 KU×m L-1,比酶活为233.6 U×μg-1分别为出发菌株的15.2倍和6.8倍。
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