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禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)可分为I群、II群、III群,可引起鸡、鸭、鹅等多种家禽或野禽的疾病。其中I群禽腺病毒又可分为12个血清型,我国鸡群中主要流行血清4型(FAdV-4)和血清8b型(FAdV-8b),分别引起心包积液综合征(Hydropericardium syndrome,HPS)和鸡包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis,IBH)等疾病,给养禽业造成严重的经济损失。纤突蛋白(fiber)是禽腺病毒的重要结构蛋白,含有病毒的中和抗原表位,也与病毒的感染性有关。本研究以耐热新城疫病毒为载体,采用反向遗传技术分别构建表达FAdV-4和FAdV-8b纤突蛋白的重组病毒,并且评价了重组病毒活疫苗的免疫效力。1.以耐热新城疫病毒为载体的I群禽腺病(4型、8b型)重组病毒的构建以FAdV-4(GX2013株)和FAdV-8b(QD2016株)基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增fiber2基因和fiber基因,再将fiber2基因和fiber基因分别插入含有NDV/rAHR09弱毒株全基因组质粒rAHR09-P的P和M基因间隔区,构建rAHR09-P-FAdV-4 fiber2和rAHR09-P-FAdV-8b fiber。将两个重组质粒分别与表达NDVNP、P、L基因的质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染BSR-T7/5细胞60 h,收毒后接种9-11日龄SPF鸡胚。经血凝试验证明拯救出重组病毒。通过RT-PCR及测序证明,fiber2基因和fiber基因分别插入了 NDV/rAHR09基因组中。将这两株重组病毒命名为rAHR09-4F2和rAHR09-8bF。Western Blot 试验显示,插入 NDV/rAHR09 中的 fiber2 基因和 fiber 基因均能够表达,两株重组病毒表达的蛋白条带大小与预期一致。耐热性试验结果显示:rAHR09-4F2和rAHR09-8bF经56℃处理70 min仍有HA活性,两株重组病毒与母本病毒均具有较好的耐热性。EID50试验测得rAHR09-4F2、rAHR09-8bF病毒滴度分别为107.42EID50/mL、107EID50/mL,两株重组病毒在鸡胚具有良好的复制能力。MDT 与 ICPI 试验结果显示:rAHR09-4F2 和 rAHR09-8bF MDT 大于 120 h,ICPI 数值均为0.050,两株重组病毒与亲本病毒毒力均无显著差异,仍为弱毒株。2.重组病毒免疫效力评价为了评价重组病毒rAHR09-4F2和rAHR09-8bF免疫效力,分别进行了免疫攻毒保护试验1和试验2。试验1分为rAHR09-4F2组、FAdV-4+FAdV-8b灭活疫苗组、攻毒对照组。7日龄SPF鸡,rAHR09-4F2组试验鸡通过滴鼻点眼接种rAHR09-4F2(106EID50),灭活苗组经颈部皮下接种FAdV-4+FAdV-8b二价灭活疫苗(0.25 mL/只)。在免疫后第7、14、21、28d对各组试验鸡采血分离血清,通过血清中和试验(SNT)测定血清中FAdV-4和FAdV-8b中和抗体滴度。试验2分为rAHR09-8bF组、FAdV-4+FAdV-8b灭活疫苗组、攻毒对照组。处理方式与试验1一致。试验1的rAHR09-4F2组和灭活苗组试验鸡在接种后21 d中和抗体均达到峰值,产生的针对FAdV-4的抗体滴度分别为102.93和103.23。免疫后第21 d,各组试验鸡经肌肉注射攻FAdV-4(107.5TCID50/mL),0.2mL/只。攻毒对照组在3d内全部死亡,rAHR09-4F2组在3 d内死亡5只,灭活苗组表现正常。分别于攻毒后3 d、7 d采集各组试验鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子,通过SYBR Green I实时荧光定量PCR的方法测定病毒含量。在攻毒后第3d、7d,rAHR09-4F2组试验鸡呼吸道和消化道排毒量均高于灭活苗组,差异均显著(P≤0.05)。rAHR09-4F2刺激试验鸡产生的抗体水平较低,对FAdV-4具有50%的死亡保护效率,rAHR09-4F2能降低试验鸡的排毒量,但效果不显著。试验2的rAHR09-8bF组和灭活苗组试验鸡在免疫后7d开始产生中和抗体,在免疫后21 d达到峰值,产生的针对FAdV-8b的抗体滴度分别为103.11和103.15。免疫后第21 d,各组攻FAdV-8b(106.5 TCID50/mL),0.2 mL/只。攻毒后,rAHR09-8bF组和灭活苗组表现正常,攻毒对照组出现拉稀现象。攻毒后第3d、7d,rAHR09-8bF组和灭活苗组呼吸道和消化道排毒量均低于攻毒对照组,且差异极显著(P≤0.01)。rAHR09-8bF组呼吸道和消化道排毒量与灭活苗相比,差异不显著(P>0.05)。rAHR09-8bF能刺激试验鸡产生较高水平的针对FAdV-8b的抗体,并能显著降低试验鸡的排毒量,保护效率可达90%左右。