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本研究通过单因素实验和多因素正交实验探讨了多个因素对日本结缕草（Zoysia japonica Steud.）不同外植体愈伤组织诱导及生长的影响,建立了高效的离体植株再生体系。在此基础上,通过基因枪轰击和农杆菌侵染对日本结缕草的遗传转化进行了研究,确立了两种转化方法的技术路线,并且将DREB1A基因转入日本结缕草不同品种中,以期获得更为抗旱、耐寒、耐盐碱的日本结缕草转基因新品系。通过近4年的研究,在以下几个方面取得了进展: 1、建立了日本结缕草离体植株再生体系。以成熟种子诱导愈伤组织,单因素实验和正交实验结果表明,选用品种‘Zenith’,在MS培养基中以植物凝胶作为凝固剂,添加2,4-D 5mg/L、6-BA或KT 0.1mg/L及CuSO4 2.5mg/L的组合效果最好。无菌实生苗各部分中,胚轴的胚性愈伤诱导培养基可选用2～3mg/L的2,4-D,添加0.05mg/L 6-BA;MS培养基添加2～4mg/L 2,4-D即可诱导芽尖获得较高的胚性愈伤率,但芽尖不易操作。胚性愈伤组织继代时要仔细挑选,继代周期为24～33d。植株再生率取决于愈伤组织的质量,1/2MS+KT 0.2mg/L培养基由于符合体细胞胚的发育,效果较好。 2、确立了日本结缕草转化子筛选方案。对于基因枪法,采用延迟筛选的方式,愈伤组织轰击后恢复培养5d,然后转入含有50mg/L潮霉素的愈伤组织继代培养基上,每月继代一次,筛选2个月,抗性植株再生培养基中,潮霉素浓度降至20mg/L;对于农杆菌介导转化法,转化子筛选过程中潮霉素用量与基因枪转化系统相同,但附加200mg/L头孢霉素作为抑菌剂。 3、建立了日本结缕草基因枪转化体系。其技术要点为:1100psi的轰击压力下,选用直径为1μm的金粉、每枪500μg金粉+1μg DNA、6cm的轰击距离、轰击两次的基因枪转化参数,选择诱导4个月、继代培养25d左右的胚性愈伤组织进行基因枪轰击,靶材料在轰击前4h至轰击后12h间,培养于含有甘露醇及山梨醇各0.2M的高渗培养基上。 4、建立了日本结缕草农杆菌介导转化体系。主要采用以OD600为0.5的农杆菌LBA4404菌液侵染转化经过预培养的胚性愈伤组织20min（0.08MPa真空处理5min）,共培养2d后洗去农杆菌,将愈伤组织转至含潮霉素和头孢霉素的筛选培养基上。在工程菌液及共培养基中均添加100μM乙酰丁香酮。 5、获得了转入DREB1A基因的日本结缕草。以基因枪转化‘Zenith’、‘Liaoning’和‘Qingdao’3个品种,获得移栽成活的潮霉素抗性株系16株,‘Zenith’、‘Liaoning’和‘Qingdao’3个品种的抗性植株获得率分别5.6%、7.62%和2.08%。农杆菌介导转化‘Zenith’,获移栽成活抗性植株2株,抗性植株