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目的:胚胎干细胞(ESCs)是指从内细胞团分离的多潜能细胞,它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。细胞分化的命运决定受到多种信号分子和转录因子的精确调控,因此深入了解细胞分化中的调控机制能够帮助诱导特定类型的细胞群,用于医学治疗。近年研究发现,转录后调控,特别是非编码小RNA(microRNAs),成为调控细胞分化的一种重要方式,然而精确调节细胞命运的microRNA仍然有很多是未知的。 为了明确microRNA对ESCs分化的调控作用,本课题通过对分化不同时期miRNA的表达检测,筛选出变化幅度大的microRNA进行后续实验。同未分化时期相比,其中miR-125b表达量是在分化过程中变化幅度最剧烈的几个之一,揭示其在分化调控中可能起到重要作用。 方法:本课题首先建立了miR-125b过表达的mESCs稳定株,通过碱性磷酸酶染色、未分化细胞特异性标志蛋白表达分析鉴定细胞株的未分化状态;利用悬滴法的体外干细胞分化模型,通过早期胚层分化细胞标志基因和终末端细胞标志基因的表达分析鉴定miR-125b过表达系的三个胚层的分化能力:通过报告基因系统筛选到靶基因Lin28;通过构建Lin28的下调及过表达稳转系验证miR-125b/Lin28通路对分化的调节作用。 结果:研究发现miR-125b在ESCs中高表达,随着分化剧烈下调,过表达miR-125b后并不影响胚胎干细胞的全能性,但在分化过程中使大部分细胞钳制在未分化状态,并抑制了除外胚层之外的中内胚层分化,以及末期的心肌分化。Lin28是miR-125b的下游靶基因,在分化过程中Lin28的表达谱与miR-125b的相反,mig-125b通过结合到Lin28的3’非编码区,抑制Lin28的表达。下调Lin28可以导致与miR-125b过表达后相似的细胞分化障碍,而在miR-125b过表达系上补回Lin28后,可在一定程度上减轻miR-125b造成的胚层和心肌分化障碍。另一方面,在分化中当用培养内胚层样细胞END-2的培养基代替普通培养基来模拟正常内胚层环境时,可以很大程度恢复mig-125b过表达系的心肌分化率,提示内胚层的分化异常可能是造成心肌分化的原因。 结论:研究结果证明了miR-125b/Lin28这条信号通路在启动胚胎干细胞分化和细胞命运决定中有重要的作用。