一、研究背景在经济日益繁荣的今天,人们对美的要求越来越高。良好的外形不仅给人以舒适感,在工作中也会给自己带来不少优势。毛发是人体美的重要组成部分,一头乌黑亮丽的头发不仅是年轻、健康的象征,更能增加人的美感。同时毛发有重要的生物功能如对身体的机械性保护,防日晒、御寒,调节体温,触觉作用等。随着现在生活节奏日益加快,工作、生活中的压力逐渐增大,人们的生活习惯也发生巨大变化,脱发患者越来越多。脱发不仅使患者的生理功能受到一定影响,同时对患者的社会交往和心理健康造成了极大的负担。目前脱发治疗已成为热点。根据不同病因,脱发可分为瘢痕性和非瘢痕性脱发。瘢痕性脱发有淋巴细胞、中性粒细胞等导致的原发性瘢痕性脱发和由于先天性、遗传性或者发育缺陷、感染、物理和化学损伤及免疫反应等造成的非原发性瘢痕性脱发。非瘢痕性脱发主要有雄激素性脱发、斑秃、生长期脱发、休止期脱发、拔毛癖等。其中以雄激素性脱发最常见。脱发的治疗包括非手术治疗和手术治疗。非手术治疗可分为药物治疗、中医治疗、激光治疗、假发、织发及其他修饰掩饰技术。非手术治疗以药物治疗为主,使用的药物主要是米诺地尔和非那雄胺。然而这两种药物只能暂时性延缓脱发的进展,使已经微型化的毛囊增粗,而且须长期用药。如停止药物的使用,脱发区毛发又会进行微型化过程,且该方法对已没有毛囊的头皮没有作用。手术治疗以自体毛发移植技术最常用。该方法是将后枕部优势供区的毛囊移植到脱发区域,实现毛囊的再分布。自体毛发移植技术是目前治疗秃发唯一持久有效的方法,且很多秃发患者术后效果显著。但该方法对于大面积秃发患者而言,存在供区不足问题。而再生医学的发展,为解决这一问题提供了可能。为了实现毛囊再生,很多学者进行了大量的研究,并取得了一定成果,分别在体内和体外构建出了毛囊再生模型。体内毛囊重建模型主要有小室法、注射法、皮瓣法、三明治法、肾包膜法。小室法是在裸鼠背部做一深达肉膜的圆形创面,用一大小合适的钟形硅胶室覆盖全层创面并固定,将制成的细胞悬液注入小室内,3周后可观察到新生毛发。但该方法动物利用率较低,细胞用量大。注射法是直接把制备好的新生鼠的真皮细胞和表皮细胞混合后注射到裸鼠皮下,18天即可诱导出毛囊。虽然该方法提高了动物利用率,减少了细胞使用量,但是新生毛囊方向杂乱无章。三明治法是指将新鲜分离的毛乳头细胞置于分离的表皮和真皮层之间并将其植入皮下诱导毛囊再生,该方法操作较复杂。皮瓣法是由三明治法发展而来,在免疫缺陷小鼠背部做三边开放的矩形皮瓣,将新鲜分离的胎鼠表皮置于硅胶板上,将分离的毛乳头细胞移植到表皮上,把硅胶板放到皮瓣下,细胞面朝上,将切口缝合,待毛囊形成后将皮瓣翻转,移去硅胶板。该方法需要二次手术。肾包膜法是将真表皮细胞移植到肾脏包膜下诱导毛囊再生。回顾上述毛囊重建模型不难发现：在一定条件下,可以在动物体内人为地实现由“细胞—器官”的跨越,然而,动物体内参与该过程的因素相对较多且较为复杂,目前该发生机制并不清楚。因此上述体内毛囊重建模型也仅仅适用于检测毛乳头细胞的诱导能力,无法应用于临床。体外环境相对简单,便于观察毛囊再生的全部过程。因此,为了在体外实现毛囊再生,学者也同样进行了大量研究。目前,在体外可构建出原始毛发样结构。但仅仅实现由“细胞—组织”的转变。体外构建的毛囊结构形态较幼稚,需进一步移植至体内才能发育成完整毛囊。因此我们不难看出,目前的体外毛囊重建模型仍然太过简单,不足以为毛囊再生提供适宜的微环境(细胞、细胞因子、信号分子和营养物质等),导致体外诱导的毛囊单位形态不成熟。已有大量研究证实脂肪细胞、毛囊间表皮干细胞、骨髓细胞等细胞成分,TGF、VEGF等生长因子及Wnt、BMP等信号分子对毛囊再生有重要作用。但是哪种成分起关键作用仍不得而知。因此我们以经酶分离得到的新生鼠的细胞通过毛囊体内重建模型先探究不同宿主对毛囊重建的影响,再研究宿主细胞是否参与了毛囊重建的过程,最后通过Cell-in-a-box试剂盒隔绝宿主细胞,探究在没有宿主细胞参与的情况下毛囊重建的情况。以期通过上述研究对体外毛囊重建受限做出解释,探究毛囊重建微环境,为将来的体外毛囊重建提供指导。一、不同宿主对毛囊重建的影响目的：明确不同宿主对毛囊重建的影响方法：取出生1天内的GFP乳鼠,PBS(含1%青链霉素)清洗1次,剥离皮肤,PBS(含1%青链霉素)清洗3次。0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜,将表皮和真皮分离并分别剪碎,真皮用0.2%胶原酶37℃消化1小时,每15分钟吹打振荡1次。表皮用0.25%胰酶37℃消化10分钟。制备成新鲜分离的真皮和表皮细胞,加人DMEM高糖培养基重悬,细胞计数。取部分真皮、表皮细胞以2：1比例混合,表皮细胞分别为0.1×106个、0.5×106个、1.0×106个、2.5×106个。同时,将剩余表皮细胞与真皮细胞以不同的比例混合,分别为表皮细胞0.1×106个±真皮细胞1×106个、表皮细胞0.5×106个±真皮细胞1.0×106个、表皮细胞2.5×106个±真皮细胞1.0×106个,表皮细胞0.5×106个,真皮细胞1×106个,各组细胞组合均以100ul高糖DMEM重悬,且100u1为1个单位,备好细胞悬液待注射。无菌条件下注射于裸鼠及脱去背部毛发的C57BL/6鼠背部中线两侧。每只鼠注射6个点。每天观察注射部位皮肤的颜色变化。于术后2、4、7、14、18、21天移植部位取材,随后每隔3天取材,直至观察到新生毛囊重新进入生长期,体视镜下观察,做石蜡、冰冻切片,正置显微镜下观察。取移植后21天形成的毛发做扫描电镜检查。将各细胞量组合的注射点在14天取材,对形成的毛发进行计数结果：裸鼠和C57BL/6鼠体内均可形成新的毛囊,新生毛囊在诱导阶段大致相同,4天有黑色毛球形成,7天形成毛干。但C57BL/6鼠新生毛囊在18天进入退行期,而裸鼠在21天。C57BL/6鼠新生毛囊在33天重新进入生长期,裸鼠则在39天。石蜡切片见再生毛囊结构完整,冷冻切片荧光检测见明亮绿色荧光。细胞以不同的比例移植后发现,C57BL/6鼠体内毛囊重建效率高于裸鼠,且二者的真表皮细胞的最佳比例不同,单一细胞移植至两种鼠体内时均无毛发形成。裸鼠体内形成毛发直径与正常毛发相近,但明显较C57BL/6鼠体内形成毛发直径粗。结论：以两种不同种系的老鼠作为宿主,通过注射法重建毛囊,两种老鼠体内毛囊重建效率不同,且重建毛囊的生长周期和毛干的直径也有明显差异,宿主因素对毛囊的形态发生有重要影响。二、毛囊重建过程中宿主细胞的参与情况目的：明确非皮下注射时宿主细胞是否参与毛囊重建过程方法：取出生1d内RFP乳鼠皮肤,PBS(含1%青链霉素)清洗,0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜,然后用显微镊将表皮和真皮分离并分别剪碎,真皮用0.2%胶原酶37℃消化1h,表皮用0.25%胰酶消化10mmin。消化结束后各加入等体积DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清)终止消化,制备成新鲜分离的真皮和表皮细胞悬液,细胞计数。将真皮细胞和表皮细胞以2：1的比例混合,调整细胞浓度为1.5×107ml,100 ul为1个单位,备好细胞悬液待注射。GFP鼠麻醉后去除背部毛发,常规消毒,将制备好的细胞悬液每次1单位,无菌条件下注射至肉膜下,每只鼠注射6个点作为对照。每天观察注射部位皮肤的颜色变化,14d后取材,常规石蜡切片、HE染色、冰冻切片及DAPI染色,镜下观察。结果：注射后第4d可见注射部位皮肤变灰,并有轻微隆起。第8d,皮肤颜色加深,呈黑色。随后由于RFP鼠自身毛发生长,不易观察。第14d取材发现,单独注射表皮或者真皮细胞组未见毛发形成,表皮和真皮细胞混合注射可见大量毛囊形成,毛囊结构完整。石蜡切片见肉膜完整,新生毛囊位于肉膜下层。冰冻切片及DAPI染色可见新形成的毛囊中大部分为红色荧光细胞,少部分为绿色荧光细胞。结论：利用两种表达不同荧光蛋白的老鼠以注射法重建毛囊,通过观察荧光细胞分布,发现重建的毛囊中有宿主细胞,即宿主细胞参与了毛囊重建过程。该方法简化了操作过程,有较强特异性。但宿主细胞的具体来源仍不清楚,有待进一步的研究。三、宿主细胞在毛囊重建中的作用目的：验证无宿主细胞参与下毛囊体内构建是否能够完成方法：1.1将出生1d内的GFP、RFP转基因乳鼠处死后,于浓度为75%的乙醇中浸泡20S后,PBS(含1%青链霉素)清洗3次,剪去鼠尾巴和四肢后剥离皮肤,PBS(含1%青链霉素)清洗3次。0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜,将表皮和真皮分离,并分别剪碎,真皮用0.2%胶原酶37℃消化1h,每15 min吹打振荡1次。表皮用0.25%胰酶37℃消化10min。分别制备成分离的真皮和表皮细胞悬液,细胞计数。1.2囊球的包裹 取RFP表皮细胞0.7×106,GFP真皮细胞1.4x106,按产品说明包裹细胞,包裹完成后用无菌的PBS反复清洗制备的囊球,备用。1.3囊球的体内移植及体外培养 将裸鼠常规麻醉消毒,将含表皮和真皮细胞的囊球移植于裸鼠皮下,移植空白囊球作为对照,每只裸鼠移植一个点,每点移植10个囊球,每组各6只裸鼠。剩余囊球置于培养皿中,培养基为(DMEM+10%FBS:Cnt07=2:1),将培养皿置于37℃、5%CO2培养箱中培养。定期镜下观察囊球中细胞生长情况。1.420天后将部分体外培养的囊球中的细胞球取出重新接种,观察细胞迁出情况；部分细胞球做常规石蜡切片,HE染色。剩余囊球继续体外培养。10天后将体内移植的部分囊球取材,镜下观察,将细胞球取出部分用于做常规石蜡切片,HE染色。剩余部分囊球继续体内培养,40天后取材观察。1.5将体内移植10天后的囊球中的细胞球重新取出移植到裸鼠体内,观察毛发形成情况。1.6用RFP乳鼠真皮和表皮细胞重复上述步骤,将体内移植10天后的囊球中的细胞球重新取出移植到GFP鼠体内,观察毛发形成情况。结果：包裹的细胞体外培养时逐渐发生聚集,形成细胞球,于包裹后第10天细胞球形态趋于稳定,石蜡切片未见明显分化现象。将形成的细胞球重新接种于培养基中,细胞球中的细胞可重新贴壁迁出。移植至裸鼠体内的囊球于移植后10天取材,发现囊球保存完好,未发生破裂,显微镜下见囊球中的细胞发生聚集,形成细胞球,无明显毛干,石蜡切片可见形成同心圆样结构。40天时仍未见明显毛囊样结构形成。将体内移植的囊球中的细胞球取出后移植到体内可见毛发形成。移植至转基因鼠体内的细胞球形成的毛发中可见红色荧光细胞。结论：新生鼠的真表皮细胞用cell-in-a-box试剂盒包囊后仍可以存活,该试剂盒可以较好地隔绝宿主细胞,隔绝宿主细胞后,无法成功诱导毛发再生,证明无宿主细胞参与条件下,体内无法构建成熟毛囊,宿主细胞是毛囊成熟所必需。