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背景鱼藤酮(rotenone,ROT)是一种应用广泛的、可以引起多巴胺能神经元变性、死亡的杀虫剂。多项研究表明,外界环境中的鱼藤酮对中枢神经系统的毒性作用,可能是帕金森病(Parkinson,s disease,PD)的病因之一。RBM3是一种高度保守的RNA结合蛋白,编码157个氨基酸,由于对亚低温敏感故又被称为冷休克蛋白。RBM3可结合60S核糖体大亚基、mRNA、miRNA进而增强蛋白质的翻译。已知RBM3对多种神经毒素诱发的神经细胞凋亡具有保护作用,但在PD细胞模型中的作用尚不清楚。本研究中,我们利用ROT诱导的人神经瘤母细胞SH-SY5Y细胞凋亡作为PD的细胞模型,探讨亚低温及RBM3的神经保护作用以及凋亡过程中RBM3对细胞总蛋白合成的影响。目的1.探索在PD细胞模型中,亚低温对ROT诱导的神经毒性的保护效果;2.阐明RBM3对ROT诱导的细胞凋亡的保护效果及分子机制;3.研究ROT处理细胞后,RBM3对细胞总蛋白合成的影响。方法1.ROT对SH-SY5Y细胞凋亡的影响ROT处理SH-SY5Y细胞后,利用MTT法检测不同浓度的ROT处理细胞不同时间后对细胞的毒性。2.亚低温(32℃)对ROT诱导细胞凋亡的影响32℃诱导细胞24 h后,刺激冷休克蛋白RBM3大量表达,加入ROT诱发SH-SY5Y细胞凋亡,采用MTT法检测细胞存活率,Western blotting检测凋亡相关蛋白cleaved caspase3、cleaved PARP、Bcl2和Bax的表达情况,以及TUNEL和DAPI染色法进一步分析细胞凋亡水平。ROT处理细胞后,还对自噬标志物Beclin-1蛋白的表达情况进行分析。3.过表达RBM3对ROT诱导的细胞凋亡的影响构建pXJ40-myc-RBM3过表达质粒,转染SH-SY5Y细胞48 h,ROT处理细胞,采用MTT细胞活力法检测细胞存活率,Western blotting检测凋亡相关蛋白cleaved caspase3、cleaved PARP、Bcl2和Bax的表达情况,以及TUNEL和DAPI染色法进一步分析细胞凋亡水平。同时ROT诱导细胞后,对自噬标志物Beclin-1蛋白水平的影响。4.RBM3对ROT诱导的相关信号通路的影响ROT刺激过表达RBM3细胞组,用Western blotting法检测信号分子p38、JNK、ERK、NF-κB、AMPK和GSK-3β的磷酸化水平,以确定与哪些信号通路有关。5.利用siRNA沉默RBM3后,探讨其保护作用及机制siRNA沉默RBM3的表达,再加药处理细胞,Western blotting检测cleaved caspase3、cleaved PARP的凋亡水平和p38、JNK、ERK的磷酸化水平。6.利用MAPK特异性抑制剂验证ROT诱导细胞凋亡各种MAPK特异性抑制剂处理细胞,利用MTT,Western blotting和DAPI染色技术评价抑制剂对ROT诱导细胞凋亡的情况。7.RBM3对细胞总蛋白合成(GPS)的影响过表达RBM3,利用SUnSET技术分析其对SH-SY5Y细胞总蛋白合成的影响。Western blotting检测RBM3过表达对p-eEF2的影响,以及使用MAPK特异性抑制剂后对eEF2磷酸化的影响。结果1.ROT诱导的细胞毒性存在剂量与时间依赖性;2.亚低温对ROT诱导的SH-SY5Y细胞的神经毒性具有保护作用;3.过表达RBM3基因可模拟亚低温对ROT神经毒性的抵抗效果;4.沉默RBM3基因的表达,亚低温的神经保护作用消失;5.RBM3过表达可以明显抑制ROT诱发的MAPK信号通路的活化;6.MAPK特异性抑制剂处理细胞,可抵抗ROT诱发的细胞凋亡;7.RBM3过表达可刺激细胞总蛋白合成,该效果可能依赖于RBM3对JNK和ERK信号通路的抑制作用。结论在ROT相关的PD细胞模型中,亚低温通过刺激RBM3蛋白的大量合成,来抑制ROT诱发的细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。通过研究RBM3神经保护的分子机制,发现RBM3通过抑制JNK、p38和ERK MAPKs信号通路发挥神经保护作用。RBM3可促进细胞总蛋白合成,且该作用可能依赖于JNK、ERK信号通路。这就为RBM3过表达或特异性诱导的策略在治疗PD等神经退行性疾病提供了初步的理论依据。