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DNA条形码技术是一种高效、快速的辅助形态学鉴定物种的分子鉴定技术,它能够摆脱传统分类学的桎梏,更准确、更快速的鉴定标本,并使其标准化。DNA条形码技术的产生和发展为蜘蛛生物多样性的研究带来了一次突破,使传统分类并非局限于蜘蛛的外部形态特征,有效的简化了物种的分类及鉴定工作。本研究主要以河北省小五台山自然保护区的蜘蛛标本为材料,在经典分类鉴定的基础上,利用DNA测序技术获取了28科110属240种2493条蜘蛛的线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I,COI)的基因序列。以K-2-P双参数为模型对其种内、种间遗传距离进行分析,并使用邻接法(neighbor-joining,NJ)对蜘蛛的样本进行系统发育树构建。并用jMOTU,ABGD软件分别对样本进行划分。其得到的结果与形态鉴定结果相对比,以探讨DNA条形码技术在对河北小五台山地区蜘蛛物种鉴定的可行性。同时,利用R语言ggtree包进行科级水平聚类分析,并探讨COI基因在蜘蛛科级水平上进行物种聚类是否具有可行性。结果表明:(1)通过分析jMOTU,ABGD和NJ聚类结果,表明了这3种方法在蜘蛛目的物种鉴定中都具有较高的准确性。同时,发现在形态学上鉴定为一个种,却在上述的三种方法都将其分为两个或多个的有14个种:Misumena vatia,Asianellus festivus,Philodromus cespitum,Philodromus aureoles,Allomengea dentisetis,Neoscona sp23,Agelena labyrinthica,Takayus takayensis,Pistius undulates,Trochosa ruricola,Plator sinicus,Drassodes hebei,Pardosa paratesquor,Heriaeus melloteei。并且,这些种在遗传距离上都>4.5%,可能含有隐存种。(2)在jMOTU,ABGD和NJ聚类分析中出现了结果不一致的现象,可能是由于不同的分析方法所需要的算法不同而导致的,同时也提醒我们在进行物种分析时,需要结合多种算法来具体的讨论某个问题。(3)在科一级水平上,利用COI基因序列构建的NJ系统发育树上,能将蟹蛛科、球蛛科、跳蛛科、幽灵蛛科、狼蛛科、皿蛛科、管巢蛛科、园蛛科的大部分的物种分别聚成一个单系,说明COI基因在上述科的科级水平聚类分析中具有可行性。但是,COI基因序列构建的NJ系统发育树不能将肖蛸蛛科、逍遥蛛科、平腹蛛科和漏斗蛛科的大部分物种分别的聚成一个单系,说明在这些科中,科级水平聚类分析中不具有可行性,需要增加其他基因片段(16S、28S、cytb等)来分析其科级水平聚类可行性。