背景:随着癌症免疫治疗的发展,肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)逐渐成为肿瘤免疫的研究热点,免疫治疗的阳性反应通常依赖于肿瘤细胞与TME内免疫调节的相互作用。TME中免疫细胞的分化和功能出现了不同程度的缺陷,这也导致了 TME的复杂和多变性。近年来对于TME研究表明,外泌体是其中的的重要组成部分,它既存在于生成肿瘤的局部组织,也可见于病人的血清、胸水或腹水中。外泌体通过影响细胞间信号传递从而直接或间接的调节了肿瘤细胞的功能或者肿瘤转移前微环境的形成。肿瘤来源的外泌体参与了目前已知的所有肿瘤的免疫逃逸机制,他们影响着免疫抑制细胞的分化或激活,调节其表面抗原的表达,且能够诱导T细胞的凋亡。树突状细胞因其显著的免疫激活功能而受到关注,是目前已知的最有效的专职抗原递呈细胞(APCs),成熟DCs能有效激活初始型T细胞,在激活、调节、并维持有效免疫反应中发挥重要作用,然而肿瘤驯化DCs(tumor-educated dendritic cells,TEDCs)的抗原提呈功能会有一定程度的缺失,且分化为免疫抑制性或耐受性的DCs从而限制了效应T细胞的免疫反应,具有促进肿瘤生长和转移的功能。β-葡聚糖作为一种免疫佐剂已被广泛证实具有抗肿瘤及抗感染功能。本课题拟在探讨TME及其组分对DCs的生物学功能的影响,且β-葡聚糖逆转TEDCs免疫耐受性及作用机制,为临床的恶性肿瘤诊断和治疗提供新的策略。目的:研究肿瘤细胞上清及其外泌体能够诱导体外培养小鼠骨髓源性的树突状细胞(BMDCs)的凋亡及免疫抑制性,且β-葡聚糖对其免疫抑制性的逆转作用。方法:以LLC细胞上清差速离心法提取外泌体,用GM-CSF和IL-4在体外培养诱导小鼠骨髓源性的树突状细胞,并于培养第一天加入制备好的LLC-exo悬液。应用Western-blot测定外泌体表面的相关蛋白如Hsp70、CD63、CD9、Alix的表达;于铺下细胞的第七天收获DCs用于进一步的实验。应用血球计数法及Annexin-V、7-AAD双染检测DCs的凋亡程度;用Transewell实验检测外泌体对DCs迁移的影响;分别用去外泌体和未去外泌体的LLC细胞上清培养BMDC后提取RNA。Real-time PCR(qRT-PCR)检测BMDC中免疫功能相关细胞因子Arginase-1、CCR7、INOS、IL-12、IL-6、TNF-a mRNA的表达;β-葡聚糖与肿瘤驯化的DCs的共培养后,用流式细胞术检测其表面分子的表达,ELISA检测其分泌的细胞因子的蛋白水平的表达情况;qRT-PCR检测其细胞因子在转录水平的表达情况,胞内染色实验测定TEDCs诱导CD4+T细胞的分化情况,体内体外迁移实验测定β-葡聚糖对TEDC迁移能力的影响。结果1 Western-blot 结果显示 LLC-exo 有 Hsp70、CD63、CD9、Alix 等外泌体相关蛋白的表达。与对照组相比经LLC-exo作用后的BMDC发生凋亡,且随LLC-exo浓度增加,BMDC的凋亡指数上升;Transewell体外迁移结果显示外泌体能够抑制DCs的迁移;去除和未去除外泌体的LLC细胞上清对BMDCs均有一定得免疫抑制作用,与正常培养BMDC相比,两种上清均导致BMDC的CCR7、INOS、TNF-a的mRNA的表达量下调,其中未去除外泌体组下调更加显著,Arginase-1、IL-12等细胞因子的mRNA表达量上升,其中去外泌体组上升更为显著。2 葡聚糖上调TEDCs表面的共刺激分子及MHC-Ⅱ类分子的表达,刺激后TEDCs 能够分泌大量的 TNF-a and IL-12p70,但是 IL-10,IL-4 和 IL-23 分泌并无显著变化;实时荧光定量PCR结果显示,经β-葡聚糖刺激后的TEDCs上调了 TNF-a、IL-12p40、iNOS 和 IL-6 的 mRNA 的表达,而下调了 Arginase-1 和TGF-β mRNA的表达水平:体内体外迁移实验均证实β-葡聚糖能够诱导增强TEDCs的迁移能力。结论:1肿瘤微环境及其组分外泌体能够诱导DCs的凋亡,抑制其体外迁移能力,产生免疫抑制作用。2 β-葡聚糖能够诱导肿瘤驯化的树突状细胞的成熟,增强其迁移能力,刺激其产生促免疫效应的分子及细胞因子,逆转其免疫抑制的特性。