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第一部分：TGF-β1对胰腺癌细胞神经转移相关因子NGF表达的影响研究目的：胰腺癌细胞具有嗜神经转移特性。神经转移是胰腺癌的独立预后指标,也是胰腺癌根治术后早期复发的原因。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)通过自分泌和旁分泌的方式对胰腺癌细胞嗜神经转移起着重要作用,相关的机制研究较为广泛。转化生长因子β1(transforming growth factor beta1, TGF-β1)及其受体在有神经转移的胰腺癌组织中表达升高,但其对神经转移的作用机理不明。TGF-β1能够诱导神经细胞、牙髓细胞和胰腺星形细胞NGF的表达,但是对胰腺癌细胞尚未有相关的研究证据。本研究的目的是观察TGF-β1对胰腺癌细胞NGF表达的影响,探讨TGF-β1在胰腺癌细胞嗜神经转移中的作用机理。研究方法：以Panc-1、MIA PaCa-2和BxPC-3三种不同分化程度的胰腺癌细胞系作为研究对象,用重组人TGF-β1蛋白进行孵育。运用Real-time RT-PCR、Western Blot检测上述三种细胞中NGF基因的mRNA和蛋白表达量,运用双抗体夹心ELISA法检测细胞培养液中NGF的含量,比较不同TGF-β1浓度(0、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0ng/ml)和不同的孵育时间(24、48、72h)对胰腺癌细胞NGF表达的影响；再用TGF-β1中和抗体与重组人TGF-β1蛋白共同孵育胰腺癌细胞,观察和比较使用TGF-β1中和抗体前后胰腺癌细胞NGF表达量的变化,验证重组人TGF-β1蛋白对胰腺癌细胞NGF表达的影响。研究结果：TGF-β1能够上调Panc-1和MIA PaCa-2细胞系的NGF表达,但是对BxPC-3细胞系则没有影响。TGF-β1对胰腺癌细胞NGF表达量的影响存在浓度和时间依赖关系。随着TGF-β1浓度的递增,Panc-1和MIA PaCa-2细胞系的NGF表达量先升高后下降,但均高于不使用TGF-β1的对照组。随着孵育时间的延长,NGF的表达量随之上升。Panc-1和MIA PaCa-2细胞系的NGF表达量的最高值分别出现在TGF-β1终浓度为5.0ng/ml (72h)和1.0ng/ml(72h)时。TGF-β1中和抗体能够减弱TGF-β1对Panc-1和MIA PaCa-2细胞系NGF表达的上调作用。研究结论：TGF-β1可以引起胰腺癌细胞NGF过表达,但是可能有一种负性调控机制同时参与了这个过程；TGF-β1可能通过诱导NGF的过表达参与胰腺癌细胞嗜神经转移过程。第二部分：ALK5在TGF-β1诱导胰腺癌Panc-1细胞NGF表达中的作用研究目的：探讨ALK5在TGF-β1诱导胰腺癌Panc-1细胞NGF表达过程中的作用,阐明TGF-β1诱导NGF表达的机制。研究方法：应用Western Blot方法检测不同浓度的TGF-β1(0.5、1.0、5.0、10.0、50.0ng/ml)对Panc-1细胞ALK5表达的影响。设计和合成2条针对ALK5基因的siRNA,并用Real-time RT-PCR和Western Blot检测其基因抑制作用。选择基因抑制效果最佳的一条siRNA,将其转染胰腺癌Panc-1细胞。然后用TGF-β1孵育转染后的Panc-1细胞,利用Real-time RT-PCR、Western Blot检测细胞中NGF的mRNA和蛋白表达,利用双抗体夹心ELISA法检测细胞培养液中NGF的含量,比较siRNA转染前后NGF表达量的差异。利用ALK5选择性抑制剂SB431542和TGF-β1共同孵育Panc-1细胞,用ELISA检测NGF表达的变化。研究结果：Panc-1细胞的ALK5蛋白表达随着TGF-β1浓度的增高而显著增高(P<0.05)。成功合成两条针对ALK5基因的siRNA, Real-time RT-PCR和Western Blot检测表明两者均有抑制ALK5基因表达的作用,其基因抑制率分别为70.92%和42.70%。在TGF-β1蛋白孵育下,经ALK5siRNA转染的Panc-1细胞,其NGF表达量显著高于未转染的细胞(P<0.05)。SB431542和TGF-β1共同孵育的Panc-1细胞NGF表达量高于单独使用TGF-β1的细胞(P<0.05)。研究结论：ALK5在TGF-β1诱导Panc-1细胞表达NGF的过程中起着负性调控作用。