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已有的研究表明,高等植物的两侧对称花是由辐射对称花经过多次、独立的进化事件演化而来。在玄参科植物金鱼草中,两个被称为TCP基因的转录因子,CYC/DICH,控制了花发育的背腹不对称性及其花瓣形态建成。为探究两侧对称花发育的分子机制及其进化,我们选择了与玄参科亲源关系较远的豆科蝶型花亚科的百脉根为研究对象,开展相关的研究。我们已经报道了在百脉根的两侧对称花的起源中,TCP基因同样被招募到花发育的遗传调控网络中,其中一个关键调控因子LjCYC2在进化中特化成背属性因子;而且也鉴别了一个控制百脉根侧花瓣发育的属性因子Keeled Wings in Lotus(KEW)。
本研究通过图位克隆,得到了控制侧花瓣的属性因子KEW发现它也编码一个TCP蛋白(LjCYC3),与LjCYC1与LjCYC2同属一个小的TCP基因家族。LjCYC3与LjCYC1/2来源于豆科中同一祖先TCP基因的复增事件,并在功能上发生歧化,成为不同于背属性因子的侧属性因子。通过转基因过量表达LjCYC蛋白,发现LjCYC1/2/3在决定花瓣属性上存在等级上位关系:与过量表达LjCYC1/2能改变翼瓣(侧花瓣)和龙骨瓣(腹花瓣)的形态的结果不同,过量表达LjCYC3只能改变龙骨瓣(以及具有腹花瓣特征的侧花瓣)的属性,使其形态转化为与侧花瓣类似。对这些蛋白进行细胞定位研究发现:LjCYC1/2/3融合蛋白在花瓣器官中具有不同的亚细胞定位;LjCYC2融合蛋白在洋葱细胞中能与LjCYC3融合蛋白形成异源二聚体,同时能改变LjCYC3蛋白的亚细胞定位。这些结果提示了LjCYC1/2/3之间在蛋白质水平上的不同行为、相互作用可能与它们在遗传发育上决定不同的花瓣属性、等级上位关系有关。
通过转基因遗传互补实验,本文发现LjCYC3的5’启动子区域无法维持LjCYC3只在背部和侧部花瓣表达的特征;却足以让LjCYC3行使调控侧花瓣发育的功能。这表明LjCYC3的表达和功能涉及了两个可分开的转录调控机制:一个是全局式(Global)的转录抑制机制,控制了LjCYC3沿背腹轴向在花器官中的不对称表达;另一个是局部式(Loca1)的转录调控系统,调控了LjCYC3对侧花瓣的形态建成。通过研究LjCYC2的启动子活性,我们发现LjCYC2基因的转录调控也涉及了与LjCYC3类似的机制。
本文还发现,LjCYC3在调控侧花瓣发育过程中涉及了一些重要的互作因子。其中Modifier of KEW(MOK)的突变导致kew1在杂合子状态下呈现半显性的突变表型:侧部花瓣表现出部分腹属性的特征(花瓣顶部的部分细胞形态特征受到影响,出现腹属性的特征细胞类型)。依据遗传、分子和细胞形态等数据,本文讨论了LjCYC3基因的生物学功能与百脉根花瓣形态建成分子机理的关系。