二十二碳六烯酸(DHA,22：6n3)是一种重要的多不饱和脂肪酸(polyunsatumted fatty acids, PUFAs),能够在一定程度上预防和治疗某些疾病,对人体健康非常重要。由于缺乏某些酶,人体无法自己产生DHA以供机生长发育,所以只能从饮食中获取。目前,利用转基因技术已经在植物体内实现了多不饱和脂肪酸DHA的生物合成,但是在哺乳动物中却很少有报道。由于不同生物对于密码子的应用不同,具有其特定的偏爱性。本研究利用密码子优化软件Codon Adaption Tool对来源于海洋微生物裂殖壶菌(Schizochytrium)的△4去饱和酶基因和盐生巴夫藻(Pavlova salina)的A5延长酶基因的原始基因序列进行改构,使之变成小鼠偏爱的密码子,以求在小鼠细胞中能成功表达。将改构后的两个目的基因分别插入表达载体pcaggs中,并使之分别带上新霉素抗性基因(neomycin)和潮霉素B抗性基因(hygro),作为双基因稳定共转染的筛选标记,最后构建成重组质粒pcagga-neo-Δ4和pcaggs-hygro-Δ5,并且将只带有抗性基因的空载体pcagga-neo和pcaggs-hygro作为阴性对照。本研究采用脂质体介导的方法,将实验组重组质粒pcagga-neo-Δ4和pcaggs-hygro-Δ5进行双基因共转染至中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞亚株CHOK1中,与此同时,将阴性对照组的两个空载体也共转染到CHOK1细胞中,且对细胞的转染和筛选进行了调整和优化。对CHOK1细胞进行了G418和潮霉素B的细胞药敏学检测,分别挑选了该细胞的最适筛选浓度。同时,本研究在比较利用不同转染试剂进行目的基因的转染之后,选择了最利于我们的目的基因转染到CHOK1细胞中的脂质体LipofertamineM2000进行了稳定转染,筛选出了数目最高的阳性单克隆细胞。在用双重抗性进行压力筛选30d之后,获得了稳定转染的单克隆细胞株。从实验组和阴性对照组存活下来的单克隆中各选取40个状态良好的细胞进行扩大培养,提取细胞总RNA,再反转录成cDNA,最后进行RT-PCR检测鉴定,看单克隆细胞中是否均同时转入了两种目的基因。再从RT-PCR检测中两目的基因表达均衡的克隆中挑选一株实验组阳性单克隆38号,同时从阴性对照组状态良好的细胞克隆中挑选一株单克隆22号,分别添加底物EPA进行扩大培养并且随时观察。当细胞总密度达到90%时,进行细胞总脂肪酸的抽提和甲酯化,并用氮气进行封存。本研究利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)的方法对细胞总脂肪酸进行组分分析及鉴定。阳性细胞株RT-PCR的鉴定结果及脂肪酸组成的分析结果表明,A4去饱和酶和△5延长酶基因已经成功地在CHOKl细胞中表达并发挥其脱氢和延长作用,即可催化底物EPA转化为我们想要的多不饱和脂肪酸DHA。分析GC-MS脂肪酸测定结果可知：22号阴性对照和38号实验组阳性克隆的多不饱和脂肪酸总含量的差异并不显著,但是二者间EPA总含量和DNA总含量存在显著差异。由此可见,对照组添加的EPA尚未或者很少被细胞利用生成DHA；而实验组正是利用了EPA,将其转化生成了DHA。总之,本研究成功构建了含有改构后的目的基因A4和A5的重组质粒；成功在CHOK1细胞中进行了双基因的稳定共转染,获得阳性单克隆细胞株；最后,通过气相色谱-质谱联用分析测定了实验组和对照组的脂肪酸含量及组分,证实了A4和A5两种基因共同作用确实能够起到提高细胞DHA含量的作用。去饱和酶基因△4和延长酶基因A5共转哺乳细胞的成功表达,为探索通过转基因技术在动物体内合成DHA奠定了坚实的基础,也为合成DHA提供了一种新的视角和研究方法。