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目的：初步建立昆明小鼠ESC的分离培养体系，探索体外诱导小鼠ESC分化为NPC的诱导方法。
方法：1、6～8w龄雌性昆明小鼠腹腔内注射PMSG7.5IU/只，48h后注射hCG7.5IU/只，然后与10W龄雄性昆明小鼠1：1合笼，次日晨雌鼠见栓者记为妊娠0.5d。2、于妊娠3.5d冲胚，将冲出的囊胚分别应用于单纯ESC培养系统、KSOM-ESC培养系统。前者直接利用ESC培养基在饲养层上培养并孵出囊胚；后者先应用KSOM液滴培养囊胚至孵出，再改用ESC培养基于饲养层上培养孵出的囊胚。3、将囊胚置于预先制备好的MEF上培养，酶-机械法分离囊胚ICM，观察可传代的囊胚ICM数与原代ESC的克隆形成率。4、对培养的ESC进行Oct-4染色和AKP染色鉴定，并检测其体外分化能力。5、在无hLIF存在的条件下将ESC悬浮培养4d，形成EBs，再经RA诱导4d，在NPC筛选培养基中扩增，采用免疫细胞化学方法检测NPC特异性标志物Nestin的表达。
结果：1、不同培养系统对孵出囊胚状态的影响：在KSOM-ESC培养系统中，KSOM液滴中处于囊胚ICM状态的囊胚腔逐渐增大，待取出时胚胎扩展更加充分，一侧突出一个大泡但未突破透明带，此为正在孵出的囊胚。孵出后仍维持有腔的囊胚状态，表明胚胎的质量良好。移入饲养层后即贴壁，囊胚ICM开始增殖；在单纯ESC培养系统中，囊胚培养24h后开始孵出并贴壁，囊胚ICM逐渐增大，最后ICM将囊胚腔充满。2、不同培养系统对原代ESC克隆形成率的影响：KSOM-ESC培养系统、单纯ESC培养系统的囊胚总数分别为154只和131只，差异无显著性(P>0.05)；两种培养系统的囊胚ICM可传代数量分别为89只和80只，增殖到能够离散的程度基本相似(57.8％，61.1％，P>0.05)；原代ESC囊胚ICM离散后出现集落数分别为31个和38个，克隆形成率差异无显著性(20.1％，29.0％，P>0.05)。3、ESC鉴定结果：所分离得到的ESC的Oct-4染色和AKP染色均呈阳性，符合ESC的一般特性。4、ESC体外分化能力检测结果：ESC团块悬浮培养4d时，形成由上百个细胞组成的球状EBs。5、ESC经RA初步诱导，NPC选择性培养基筛选培养7d后，形成大量神经球样结构，所形成的神经球样结构Nestin表达阳性。
结论：1、初步建立昆明小鼠ESC分离培养体系。2、单纯ESC培养基一步法与KSOM-ESC培养基两步法孵出囊胚所获得的ESC集落形态类似，均具有ESC的形态学特征，但后者在KSOM液培养阶段有利于囊胚孵出前的早期胚胎发育同步化。两种培养方法得到的ESC其增殖及克隆形成能力基本相似。3、体外分离得到的昆明小鼠ESC经RA诱导4d后，再经选择性培养基筛选培养获得大量NPC。