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强直性肌营养不良1型(DM1)是由DMPK基因的3’非编码区(3’UTR)中异常扩增的CTG重复序列引起的进行性致死性神经系统疾病,目前尚没有有效的治疗方法。患者特异的诱导多能干细胞(iPS)携带该患者的全套遗传信息并具有多向分化潜能,为阐明疾病发病机理、筛选新型靶向药物和研究移植治疗新方法提供可靠的疾病模型和理论依据。基因编辑技术能够高效率定点修复iPS细胞携带的致病突变基因,为遗传性疾病的治疗提供了新的策略。随着iPS细胞技术和基因编辑技术的快速发展,使患者特异细胞移植治疗方法具有广阔的发展前景,为DM1治疗提供了新的方向。但是,目前尚未有基因修复DM1 iPS细胞系的报道。我们希望能够通过修复病人自身来源的iPS细胞的基因突变,获得不受伦理和来源限制的iPS细胞为未来进行细胞移植治疗提供健康细胞来源。但是在将其运用于临床细胞移植治疗之前必须在体外进行有效性检测,而目前在临床应用之前缺乏简单且敏感的检验指标在体外评估干预治疗对DM1骨骼肌功能影响。本项研究第一部分是拟建立经基因修复的人类DM1 iPS细胞系,消除致病突变和逆转疾病表型为进一步开展自体干细胞治疗提供细胞来源。通过TALEN技术在DMPK基因CTG重复序列上游的特异性位点插入多腺苷酸化信号(PAS),提前终止重复扩增序列的转录并消除毒性突变转录物。我们发现经过基因修复治疗的DM1 iPS细胞能够继续保持多能性,可在体内分化为畸胎瘤,在体外分化为神经干细胞和心肌细胞。通过对畸胎瘤、神经干细胞和心肌细胞的分析。我们发现基因修复的细胞DM1的表现型得以逆转。本研究第二部拟建立简单且敏感可用于体外评估骨骼肌肌母细胞功能的检验指标。通过体外培养正常人和DM1病人来源的肌母细胞,观察体外骨骼肌再生(肌管的形成)情况,探讨DM1骨骼肌再生过程中有无新的异常病理现象,研究其病理变化过程,评估肌母细胞功能,为建立潜在的新型体外评估治疗效果的检测指标提供依据。目的:1.建立经基因修复的人类DM1iPS细胞系,在体内诱导分化为畸胎瘤,在体外分化为神经干细胞和心肌细胞,研究其多能性、表型及基因型的改变,为未来自体细胞移植提供健康的细胞来源。2.体外观察DM1肌母细胞骨骼肌再生的病理现象,研究新的病理现象,建立潜在的新型评估骨骼肌细胞功能的检测指标。方法1.构建基因修复所用携有多腺苷酸化信号(PolyA signals,PAS)的供体(公司构建),培养并转染DM1 iPS细胞,使用TALEN技术导致位点特异的DNA双链断裂,通过同源重组将PAS整合到DMPK基因CTG的上游,挑选分离阳性克隆并进行表型和遗传学鉴定,筛选经基因修复成功的克隆。2.将正常人、患者及已修复的DM1 iPS克隆分别在体内诱导分化为畸胎瘤,进行HE和免疫细胞化学染色鉴定其多能性,RNA荧光原位杂交(FISH)观察有无RNA聚集体形成。3.将正常人、患者及已修复的DM1 iPS克隆体外分化为神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和心肌细胞,应用FISH观察有无RNA聚集体形成,研究早期及晚期细胞可变剪接的逆转情况。4.体外培养正常人及DM1患者的肌母细胞,通过免疫荧光观察肌母细胞肌管形成纵向过程:包括肌母细胞增殖,早期肌管形成和晚期肌管形成。5.FISH和免疫荧光研究DM1肌母细胞核内RNA聚集体在肌管形成中动态变化过程。6.共同培养不同百分比的正常和DM1肌母细胞,观察不同组合改善DM1骨骼肌再生情况来验证我们提出的核聚集和肌管形成指数作为干预效果验证的评估指标。7.通过三次独立重复实验获取计量资料,采用单因素方差分析进行统计学分析,P<0.05为统计学显着性。结果1.成功将PAS正确整合到DMPK基因CTG重复序列上游,消除了DM1 iPS细胞中的毒性RNA转录和聚集体的形成。2.经基因修复的DM1 iPS细胞克隆(13-3克隆和33-4克隆)成功形成畸胎瘤,其形成的畸胎瘤中没有毒性RNA聚集体的产生。3.经基因修复的DM1iPS细胞诱导分化的神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和心肌细胞核RNA聚集体消失并逆转了基因的异常剪接。4.体外成功培养正常人及DM1患者的肌母细胞,DM1肌母细胞无增殖能力异常。5.DM1肌管形成早期出现核内RNA聚集体累积和异常核聚集。6.DM1肌管形成晚期可见肌节功能障碍和肌原纤维变性7.正常肌母细胞与DM1肌母细胞混合培养改善了核聚集现象,验证了核聚集指数可用于治疗效果的监测指标。结论1.本研究成功建立了经基因修复的DM1iPS细胞系,促进了DM1患者的自体干细胞治疗发展。2.异常的核聚集指数和肌原纤维变性可能是简便且敏感反映DM1骨骼肌细胞异常功能的检验指标。