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肌肉生长抑制素(Myostatin)又名生长分化因子8,属于TGF-β超家族成员之一,是肌肉生长的负调控因子。当Myostatin基因的成熟肽碱基发生突变时,它表达的产物就会丧失抑制肌肉生长的功能,或该产物的抑制功能受到影响,使肌肉得以过度发育和生长,并且还会对生长性状和生产性能造成影响。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences,CRISPR)系统是一种由RNA介导的基因修饰技术,可以对外源基因片段进行修饰,是由成簇、规律间隔的短回文重复序列组成。本实验以CRISPR/Cas9技术为基础,对兔子成纤维细胞Myostatin基因进行修饰,在兔Myostatin基因的外显子成熟肽部分筛选了一个打靶位点,之后将来自产脓链球菌的Cas9基因按照兔子密码子偏好性进行优化,并将其分别合成到p UC57载体中,然后将p UC57-Cas9和p UC57-g RNA按照不同的摩尔数之比转染到成纤维细胞中,这7个比例分别是10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10,将转染后的细胞提取基因组,经过PCR、PCR产物杂交、T7E1酶切并计算其打靶效率。结果显示,当比例是2:1时,Myostatin基因的突变效率最高。再将比例为2:1实验组的细胞进行筛选单克隆,共挑选15株单克隆细胞,扩大培养之后,对细胞提取基因组、PCR,将PCR产物连接T载体、测序,测序结果显示有5株细胞存在碱基突变和碱基缺失,并且经过氨基酸序列比对,也有氨基酸序列的突变和移码。通过Western blot方法检测目的蛋白结合的情况,确认在5株存在碱基突变的细胞中有2株细胞不能与Myostatin基因抗体结合。本实验首次通过CRISPR/Cas9技术,成功的对兔子Myostatin基因进行基因修饰,并筛选出缺失Myostatin基因的兔成纤维细胞系,确定筛选的打靶位点有效,可以为后续体外转录实验,制备转基因动物的进一步研究打下基础。