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鸡坏死性肠炎(Necrotic enteritis, NE)义称鸡肠毒血.症,是由A或C型产气荚膜梭菌引起鸡的一种以小肠后段肠管增粗和黏膜坏死为病变特征的急性细菌性传染病,对全球家禽生产造成重大的经济影响。本试验选择产气家膜梭菌两个关键致病因子a毒素/磷脂酶C(a-toxin/plc)和坏死性肠炎毒素B(NetB)为抗原,构建产气荚膜梭菌plc和NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌,通过乳酸菌可表达和传递外源抗原以及乳酸菌本身可在肠道定植的特性,有效刺激肠道黏膜免疫系统,进行鸡产气家膜梭菌新型疫苗保护机制的研究。本文利用植物乳酸菌穿梭载体pSIP409构建重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB,经双酶切鉴定和序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行SppIP诱导表达.Western Blot证明重组蛋白表达成功,并且主要以包涵体形式存在,plc和NetB重组蛋白相对分子质量分别为40kDa和36kDa。重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB分别电转化植物乳杆菌NC8细胞,PCR和双酶切鉴定正确后进行SppIP诱导表达。Western Blot和间接免疫荧光鉴定表明构建的pSIP409-plc/L.plantarum和pSIP409-NetB/L.plantarum具有诱导分泌plc和NetB蛋白的能力。为研究分泌产气荚膜梭菌plc和NetB蛋白的重组植物乳杆菌作为活菌载体疫苗的免疫保护机制,进行了雏鸡免疫保护实验。免疫程序为：实验组雏鸡7-28d连续口服1×108cfu/d分泌产气荚膜梭菌plc和NetB蛋白重组植物乳杆菌分别进行免疫；同时设植物乳杆菌空载体和PBS组作为阴性对照；所有鸡只在42日龄以1×109cfu/d产气荚膜梭菌/ATCC13124株进行连续5d的口服攻菌。各免疫组雏鸡病理组织学观察显示重组乳杆菌对雏鸡无损害作用。对免疫雏鸡血清中抗plc和NetB蛋白特异性抗体和粪便裂解液、小肠洗液、肺泡支气管液和胆汁中异性抗plc和NetB蛋白slgA进行检测,结果表明口服免疫重组植物乳杆菌雏鸡血清中抗plc和NetB蛋白特异性抗体随日龄增长呈现上升趋势,且与未免疫组雏鸡有显著和极显著差异(P<0.05,P<0.01)：免疫雏鸡粪便裂解液、小肠洗液、肺泡支气管液和胆汁中slgA含量和前者呈现相似变化,甚至在免疫结束后一段时间仍会上升,且在实验检测期间与未免疫组雏鸡比较差异显著或极显著。攻菌后免疫组雏鸡各项指标有短暂下降后很快升高,且明显高于为免疫组雏鸡.临床症状、病理学变化、肠道病变评分、免疫器官指数计算和细菌分离计数等实验也证明pSIP409-plc/L.plantarum和pSIP409-NetB/L.plantarum对雏鸡产气家膜梭菌攻击起到很好的保护作用。说明所构建的重组植物乳杆菌安全有效,为重组植物乳杆菌表达系统作为口服疫苗应用提供了理论依据。