NLRP3在白藜芦醇抑制肾癌中的作用研究

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目的:  白藜芦醇(resveratrol,RSV)是一种天然多酚类化合物,广泛存在于葡萄、草莓和花生等食物中。RSV具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,还能够抵御肥胖、保护心血管、缓解阿尔兹海默症等。肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一,由于肾癌的发病机制并不是很清楚,且对化疗不敏感,常导致患者预后不良。已知炎症与癌症的发生发展密不可分,且具有相互促进的作用。炎症过程中发挥重要作用的炎症小体已得到广泛研究,其中NLRP3炎症小体最为熟知,而其在肾癌发生发展中的作用并不明确。我们希望通过观察RSV对肾癌的作用以及在此过程中NLRP3表达水平的变化来为寻找治疗肾癌的方法提供新思路。因此,本课题旨在研究RSV对肾癌的具体作用以及通过研究这一过程中炎症的变化,来揭示NLRP3在肾癌发生发展中的作用,并为研究炎症与肿瘤的关系提供新的线索。  方法:  1.CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验检测RSV对ACHN和786-O细胞的生长抑制作用。  2.划痕实验检测RSV对ACHN和786-O细胞迁移能力的影响。  3.Transwell实验检测RSV对于ACHN和786-O细胞侵袭能力的影响。  4.流式细胞术检测RSV对ACHN和786-O细胞凋亡的影响。  5.构建肾癌动物模型并随机分为两组,CON组和RSV组,CON组用25%酒精、RSV组用RSV(60mg/kg)连续灌喂40天,并观察裸鼠的生存状态如生存率和体重变化等。  6.定期用游标卡尺测量肿瘤体积,第40天肿瘤摘除后用天平称量肿瘤重量,记录数据并分析。  7.TUNEL染色和Western blot实验检测肾癌组织中的凋亡情况。  8.免疫组化染色和Western blot实验检测肾癌组织中NLRP3的表达水平。  9.Western blot实验检测nlrp3基因干扰效率。  10.划痕实验检测沉默nlrp3基因后,RSV与NLRP3对ACHN细胞迁移能力的影响。  11.Transwell实验检测沉默nlrp3基因后,RSV与NLRP3对ACHN细胞侵袭能力的影响。  12.Western blot实验检测RSV处理和干扰nlrp3基因ACHN细胞中Sirt1、NLRP3及Bax的表达水平,Real-Time PCR检测NLRP3mRNA的表达水平,Western blot实验检测肾癌组织中Sirt1的表达情况。  结果:  1.CCK-8实验结果表明,RSV对ACHN和786-O细胞的生长具有抑制作用,且呈现出剂量依赖性和时间依赖性。  2.划痕实验结果表明,RSV能够抑制ACHN和786-O细胞的迁移能力。  3.Transwell实验结果表明,RSV能够抑制ACHN和786-O细胞的侵袭能力。  4.流式细胞术结果表明,RSV可以促进ACHN和786-O细胞的凋亡。  5.通过观察小鼠生存状态可知,RSV可以提高负荷肿瘤的小鼠的生存率,饲养过程中两组小鼠体重无差异。  6.通过分析所记录的数据绘制成肿瘤生长曲线可知,RSV能够抑制肿瘤生长。  7.TUNEL染色和Western blot实验结果表明,RSV能够促进肾癌组织发生凋亡。  8.免疫组化染色和Western blot实验结果表明,RSV可降低肾癌组织中NLRP3的表达水平  9.Western blot实验结果表明,导入ACHN细胞中的NLRP3siRNA干扰效率为66.17%。  10.划痕实验结果表明,沉默nlrp3基因可以抑制ACHN细胞迁移。  11.Transwell实验结果表明,沉默nlrp3基因可以部分抑制ACHN细胞的侵袭能力。  12.Western blot实验结果表明,Sirt1在体内被RSV激活,但在体外实验中没有被激活;RSV能够使Bax表达增加而促进凋亡,然而NLRP3siRNA并未影响Bax的表达。Western blot实验和Real-Time PCR实验结果表明,RSV、NLRP3siRNA以及两者联合处理可降低NLRP3的表达。  结论:  1.RSV可以抑制肾癌细胞的生长并促进肾癌细胞凋亡。  2.RSV抑制肾癌细胞的迁移和侵袭能力,且NLRP3在该过程发挥着重要作用。  3.通过体内实验可以进一步证明,RSV可以抑制肾癌的生长并促进其凋亡,还能够降低NLRP3炎的表达,同时提高了负荷肿瘤的小鼠的生存率。
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