【摘 要】
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研究目的:miR-429在人类癌症中的作用得到越来越多的关注。近年来的多项研究显示miR-429在多种肿瘤如肾细胞癌（renal cell carcinoma）、乳腺癌（breast cancer）、胃癌（gastric carcinoma）等发挥肿瘤抑制作用。相反,在另外一些类型的肿瘤中具有肿瘤促进功能,如子宫内膜癌（endometrial cancer）、前列腺癌（prostate cance
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研究目的:miR-429在人类癌症中的作用得到越来越多的关注。近年来的多项研究显示miR-429在多种肿瘤如肾细胞癌（renal cell carcinoma）、乳腺癌（breast cancer）、胃癌（gastric carcinoma）等发挥肿瘤抑制作用。相反,在另外一些类型的肿瘤中具有肿瘤促进功能,如子宫内膜癌（endometrial cancer）、前列腺癌（prostate cancer）及肺癌（lung cancer）。相关研究表明,作为肿瘤抑制因子之一,miR-429可以抑制乳腺癌发生、发展及转移。2019年发表于《Journal of Breast Cancer》杂志的一篇报道中提出miR-429调控细胞发展并作为一种乳腺癌潜在的生物标志物。2020年相关报道也显示,miR-429通过调控CrKL和MMP9进而抑制乳腺癌骨转移。然而,miR-429在乳腺癌中的具体作用机制并不十分清楚,其潜在靶基因仍有待挖掘。miR-429的作用机制主要是通过与其靶基因mRNA的3’-UTR区域相结合,通过降解或抑制其翻译进而抑制相关靶基因表达。通过调控疾病相关基因表达最终参与人类疾病进展的调控。本研究的目的是分析miR-429对乳腺癌细胞增殖相关的抑制作用,并通过生物学公共数据库预测其潜在靶基因,拟通过分析miR-429对其靶基因的调控方式从而探讨miR-429抑制乳腺癌细胞增殖的相关分子机制。研究方法:1,收集来源于青岛大学附属医院乳腺外科手术切除并经病理证实的浸润性乳腺癌组织及配对癌旁组织。采用实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR,quantitative reverse transcription PCR）检测乳腺癌组织及配对癌旁组织中miR-429的相对表达水平。2,通过体外培养人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞和人乳腺上皮MCF-10A细胞,采用RT-qPCR技术测定乳腺癌细胞系中miR-429的相对表达水平。3,通过细胞转染miR-429 mimic或miR-429 inhibitors的方法分别构建miR-429过表达及下调表达的细胞系,采用MTT细胞增殖检测技术分析miR-429过表达或下调表达后乳腺癌细胞系的细胞增殖水平。4,通过生物在线数据库——Targetscan来预测miR-429的下游靶基因,并分析二者结合方式。5,细胞转染miR-429 mimic或miR-429 inhibitors进而过表达或下调表达相关乳腺癌细胞系中miR-429水平,然后采用RT-qPCR的实验手段来检测不同表达水平miR-429对其预测靶基因LRP1表达水平的影响。6,构建h-LRP1-3UTR-WT和h-LRP1-3UTR-MUT重组质粒,通过应用双荧光素酶报告基因活性检测系统来分析miR-429对其靶基因LRP1的调控方式。7,采用蛋白质免疫印迹（WB,western blot）的实验技术检测不同表达水平miR-429对其预测靶基因LRP1蛋白质表达水平的影响。结果:与正常乳腺组织和乳腺上皮细胞来相比较,miR-429在相关收集的乳腺癌临床组织及其癌细胞系中的表达水平均呈下降趋势。miR-429在经过表达后显著抑制了乳腺癌细胞系中MDA-MB-231细胞的增殖。下调表达miR-429对乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞增殖无明显调控作用。通过Targetscan数据库预测分析发现,LRP1为miR-429的潜在下游靶基因,且通过其3’-UTR区域与miR-429结合。MDA-MB-231细胞中过表达miR-429显著抑制LRP1的mRNA表达水平。双荧光素酶报告基因活性检测结果显示miR-429通过与其靶基因LRP1 mRNA的3’-UTR区域5’-CAGUAUUA-3’序列结合直接控制LRP1表达。蛋白质免疫印迹结果显示过表达miR-429显著抑制LRP1基因蛋白质水平表达。结论:miR-429通过调控其靶基因LRP1表达进而抑制乳腺癌细胞增殖。
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