研究背景： 顺铂(cisplatin，CDDP)是临床常用的抗肿瘤药，属细胞周期非特异性药物。它通过被动转运以非电荷形式通过细胞膜，进入细胞后氯离子被水分子取代，呈阳性电荷，然后与DNA上的碱基结合，形成链间和链内交联，破坏DNA的功能。如果这种损伤未能修复，将导致细胞生长停滞在G2期并出现凋亡及死亡。 顺铂对睾丸癌、卵巢癌、肺癌和头颈部癌等实体瘤都有很好的疗效，是多种肿瘤化疗方案中的组成药物。但是，肿瘤对顺铂产生耐药性(内在性或获得性)，影响了顺铂的临床疗效；至今为止，顺铂耐药性产生的机理仍未阐明。阐明肿瘤对顺铂产生耐药性的机理，对于减少耐药、提高顺铂的疗效、扩大顺铂临床应用范围具有重要的指导意义。 细胞缝隙连接(gapjunction，GJ)是细胞之间的一种蛋白质连接通道，广泛存在于实质性脏器(如心脏，肝脏，肾脏，中枢神经，皮肤，肌肉等)组织中。GJ提供了一种细胞与细胞之间的直接联系通道，是细胞之间信号传递的一种重要方式。GJ异常与许多疾病(包括肿瘤)的发生、发展有密切的关系。在多数肿瘤的形成过程中，常伴随GJ功能降低或消失。恢复肿瘤细胞的GJ，可抑制肿瘤细胞的生长、分化，有利于重建正常的细胞生长调控机制。因此，GJ是一种公认的肿瘤抑制因素。最近的研究证明：在培养的正常细胞和肿瘤细胞，GJ能够增强多种化学毒物引起细胞凋亡的作用。我们和其它研究发现：顺铂的细胞毒性在GJ存在的情况下显著增强。 GJ影响顺铂等抗肿瘤药物细胞毒性的机理不明。顺铂等抗肿瘤药物的细胞毒性在有GJ存在的情况下增强这一事实表明，顺铂等在引起细胞凋亡(或坏死)的同时，诱导细胞产生了某种可以通过GJ传递的“死亡信号”；这种“死亡信号”通过GJ传递到毗邻的细胞，引起其它细胞死亡或加强顺铂的细胞毒性，这种现象称为“旁细胞效应”。我们推测，当GJ功能降低时，顺铂诱导产生的“死亡信号”不能通过GJ扩散到毗邻的细胞；这种“旁细胞效应”减弱或消失将会导致顺铂的细胞毒性降低。根据此推测和肿瘤组织常伴有GJ功能降低或消失的事实，我们假设：肿瘤细胞GJ功能减退导致顺铂细胞毒性降低，这可能是顺铂耐药性产生的机理之一。 为了证明这一假设，本研究拟在转染并稳定表达Cx26/Cx32的HeLa细胞上，用多种方法改变GJ功能，通过观察GJ功能改变对顺铂细胞毒性的影响，深入探讨GJ与顺铂细胞毒性的关系。 研究方法： 在转染并稳定表达Cx26/Cx32的HeLA细胞，用“标准细胞集落形成分析法”(standardcolony-formingassay)和SRB(sulforhodamineB)法测定顺铂对细胞生长的抑制作用(细胞毒性)。 用不同密度接种细胞的方法，获得生长融合细胞(有条件形成GJ)与生长未融合细胞(无形成GJ的条件)。在上述不同密度接种的细胞，观察GJ形成对顺铂的细胞毒性影响。 用“细胞接种荧光示踪法”(ParachuteAssay)测定培养细胞间的GJ功能；并观察目前常用的能影响GJ药物oleamide，18-α-GA和RA对由Cx26/Cx32组成的GJ功能的影响。 用doxycycline控制Cormexin表达，以及用上述药物改变GJ功能对顺铂细胞毒性的影响。 实验结果： 1、不同细胞生长密度对顺铂细胞毒性的影响 细胞集落形成实验结果显示：在生长融合和生长未融合的细胞，5μM顺铂作用1小时后，都能够显著地降低细胞集落形成率。在生长融合细胞(细胞之间形成紧密接触，有条件形成GJ)，顺铂对细胞集落生长的抑制率明显高于生长未融合细胞(细胞之间未形成接触，无形成GJ的条件)。SRB结果显示，在1×103～4×104/ml的范围内，随着细胞密度的增加，5μM顺铂作用24小时后顺铂细胞毒性逐渐增强。结果表明，细胞密度增加可显著增强顺铂的细胞毒性。 2、改变Connexin表达对顺铂细胞毒性的影响 细胞接种荧光示踪实验显示，在一定范围内(0.01-1μg/ml)，随着doxycycline浓度的增加，细胞通过GJ的荧光传递功能逐渐增强。结果证明，增加doxycycline的浓度，不仅可以增加Cx的表达，而且能够增加GJ形成和功能。集落形成实验结果显示，在一定范围内(0.01—1μg/ml)，随着doxycycline浓度的升高，顺铂对细胞集落形成的抑制率逐渐增加。结果证明，顺铂的细胞毒性随GJ功能的增强而增大。 3、抑制GJ功能对顺铂细胞毒性的影响 Oleamide和α-GA是常用的GJ抑制剂，但未见有对由Cx26/Cx32组成的GJ功能影响的报道。细胞接种荧光示踪实验显示，与对照组相比，25μMoleamide组和10μMα-GA组的细胞荧光传递功能显著降低，证明oleamide和18-α-GA能降低由Cx26/Cx32组成的GJ功能。细胞集落形成实验结果显示：在高密度接种细胞(生长融合，有GJ形成)，用25αMoleamide和10μM18-α-GA抑制GJ功能，5μM顺铂对细胞集落形成的抑制率明显降低，而在低密度接种细胞(生长未融合，无GJ形成)，oleamide，α-GA对顺铂的集落形成抑制率无明显影响。结果表明降低GJ功能可降低顺铂的细胞毒性。 4、增强GJ功能对顺铂细胞毒性的影响 RA是公认GJ增强剂，但未见有对由Cx26/Cx32组成的GJ功能影响的报道。细胞接种荧光示踪实验显示，与对照组相比，10μMRA组的细胞荧光传递功能增强。结果证明，RA显著增强由Cx26/Cx32组成的GJ功能。集落形成实验结果显示：在高密度接种细胞(生长融合，有GJ形成)，使用10μMRA增强GJ功能，5αM顺铂对细胞集落形成的抑制率明显增高。而在低密度接种细胞(生长未融合，无GJ形成)，RA对顺铂的集落形成抑制率无明显影响。结果表明，增强GJ功能可增加顺铂的细胞毒性。 结论： 1.GJ形成能够增强顺铂的细胞毒性。 2.Oleamide和18-α-GA可通过抑制由Cx26/Cx32组成的GJ功能降低顺铂细胞毒性。 3.RA可通过增强由Cx26/Cx32组成的GJ功能增加顺铂细胞的毒性。