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目的：
对牛膝多糖进行化学修饰，制备硫酸化牛膝多糖和磷酸化牛膝多糖衍生物，通过动物体内外实验，对其生物活性及其药理作用进行深入的研究，探讨硫酸化修饰及磷酸化修饰对牛膝多糖活性的影响。
方法：
1.采用氯磺酸.吡啶法对牛膝多糖(AbP)进行硫酸酯化修饰，经纯化得硫酸化牛膝多糖(S-AbP)；以三氯氧磷为磷酸化试剂，对牛膝多糖进行磷酸酯化修饰，经纯化得磷酸化牛膝多糖(P-AbP)。
2.雄性SD大鼠，清洁级，体重200±20g，随机取出6只作为正常对照组，其余的大鼠禁食12h后，按55mg/kg剂量一次性腹腔注射新配制的STZ，注射后72h，尾部采血测空腹血糖，把血糖值高于16.8mmol/L并稳定一周的大鼠定为糖尿病大鼠。将糖尿病大鼠按血糖值和体重随机分为5个实验组，每组6只动物，即糖尿模型组(DM)、消渴丸组(XK)、硫酸化牛膝多糖组(S-AbP)、磷酸化牛膝多糖组(P-AbP)及牛膝多糖组(AbP)，分别给予蒸馏水、1.5g/kg消渴丸、100mg/kgS-AbP、100mg/kgP-AbP、100mg/kgAbP，以每只大鼠每天灌胃0.5ml，将消渴丸和多糖样品配制成相应浓度的溶液进行灌胃，正常对照组给予等体积的蒸馏水，持续灌胃30d。禁食12h后乙醚麻醉眼眶取血，剖腹取胰腺、肝和肾进行生化功能测定。
3.全自动生化分析仪测定血糖(Glu)、血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，并计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平(Friedwald公式)。
4.黄嘌呤氧化酶法测定血清和肝肾组织匀浆SOD活性，二硫代二硝基苯甲酸法测定GSH-PX活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量。
5.HE染色观察肾组织及胰腺组织病理切片，免疫组织化学检测肾脏TGF-β1的表达及胰腺Insulin的表达。
6.不同浓度的AbP、S-AbP和P-AbP分别直接与宫颈癌细胞Hela，肺癌细胞A549和肝癌细胞SMMC-7721共培养48h后，用MTT法检测肿瘤细胞的增殖活性：流式细胞仪观察S-AbP和P-AbP处理A549细胞后细胞凋亡的改变。
7.选择18-20g的BALB/C小鼠，无菌分离脾细胞，不同浓度的AbP、S-AbP和P-AbP分别作用于小鼠脾淋巴细胞，培养48h后，用MTT法检测淋巴细胞增殖，ELISA法测定培养上清液中IL-2和TNF-α的含量。
结果：
1.S-AbP为乳白色粉末，测得其硫酸基取代度为2.39;P-AbP为白色粉末，测得其磷酸基取代度为0.70。
2.S-AbP和P-AbP均使糖尿病大鼠体重增加，血糖显著降低，且S-AbP的降糖效果优于AbP和消渴丸。S-AbP还使血清TC、TG和LDL-C水平降低，HDL-C水平显著升高；P-AbP使血清TG水平降低、HDL-C水平升高；AbP使血清HDL-C水平升高。
3.S-AbP显著降低血清BUN和Scr水平，P-AbP和AbP显著降低Scr水平。
4.S-AbP使糖尿病大鼠血清和肝肾组织SOD和GSH-PX活性显著升高，MDA水平降低；P-AbP使肝组织SOD活性升高，血清和肾组织GSH-PX活性升高，肾组织MDA浓度显著降低；AbP除了部分改善血清和肝脏的抗氧化酶活性，对MDA浓度没有显著影响。
5.S-AbP显著减轻肾组织病变程度，并下调TGF-β1的表达；P-AbP和AbP对TGF-β1的表达无明显影响。S-AbP减轻胰腺组织的病理损伤，使胰岛素阳性反应细胞增多。
6.AbP、S-AbP和P-AbP在25～400mg/L浓度范围内对Hela细胞的增殖无显著抑制作用；S-AbP在25～400mg/L浓度范围显著抑制肿瘤细胞SMMC7721和A549的增殖，且对A549细胞的抑制作用较强，并显现剂量效应；P-AbP在一定浓度范围显著抑制SMMC7721(100～400mg/L)和A549(25～400mg/L)细胞的增殖；AbP在一定浓度范围显著抑制SMMC7721(200～400mg/L)和A549(25～400mg/L)细胞的增殖。S-AbP和P-AbP抑制SMMC7721和A549细胞增殖的作用较同浓度的AbP强。流式细胞仪分析显示，S-AbP和P-AbP均可不同程度诱导A549细胞凋亡。
7.一定浓度的S-AbP(25～400mg/L)和P-AbP(100～400mg/L)均显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，且其促增殖活性均较AbP强。P-AbP在25～400mg/L浓度时显著诱导脾淋巴细胞分泌TNF-α，对IL-2的分泌无明显影响；S-AbP在25～400mg/L浓度时诱生较高含量的IL-2，对TNF-α的分泌无明显影响；AbP在100～400mg/L浓度时显著诱生TNF-α。
结论：
1.S-AbP和P-AbP对STZ诱导的大鼠氧化应激具有保护效应，使糖尿病大鼠体重增加，血糖、血脂水平降低，且S-AbP效果优于AbP，这可能与硫酸基的取代，使得糖链的构象发生改变，S-AbP的抗氧化作用增强有关。
2.S-AbP能够减轻糖尿病大鼠肾组织病变程度，改善肾功能，对糖尿病并发症的控制有一定的作用。
3.S-AbP和P-AbP对肿瘤细胞的抑制作用具有一定的选择性，对人肺癌A549细胞的抑制作用显著，并且S-AbP和P-AbP较AbP能更有效地抑制肿瘤细胞的增殖，其机制可能是通过诱导细胞凋亡而实现。
4.S-AbP和P-AbP较AbP能更有效地促进淋巴细胞增殖，还可以分别通过IL-2和TNF-α发挥免疫调节作用。