E2促进输卵管上皮细胞β-防御素1表达通路及转录组学分析

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防御素是一种广泛存在于生物界的可以杀死细菌、真菌或者病毒等微生物并有抗肿瘤活性的短肽,是先天性免疫系统的重要组成部分。研究表明,绵羊血液中雌激素的变化会引起其生殖器官β-防御素1(sheep beta defensin 1 SBD-1)表达量的变化,并呈正相关。进行体外雌激素对绵羊输卵管上皮细胞内SBD-1表达调控机制的研究,对研究雌激素和粘膜免疫的关系意义较大。本实验通过RT-qPCR技术检测不同浓度的17-β雌二醇(17β-estrodiol E2)、作用不同时间后对培养的绵羊输卵管上皮细胞SBD-1表达的影响,确定出适合的添加剂量和时间。实验结果表明,10-8mol/L为E2刺激最佳的浓度,3.5 h为其最高表达量时间点,与对照组0h相比有显著性升高(P<0.05),3.5h后随着时间的增加,SBD-1的表达量逐渐降低,但均高于对照组。通过对E2作用培养的输卵上皮细胞进行转录组学分析,结果表明,在所有差异基因中共有619个富集到GO-Term中,其中显著性富集到生物过程的基因有氧化还原过程、毒素代谢过程、蛋白定位到着丝点、细胞对有机环状化合物的反应等;显著性富集到细胞组分的基因有细胞外囊泡外泌体、细胞外空间、质膜的整体组分、细胞表面、细胞外区域等;显著性富集到分子功能的基因有:蛋白质结合、钙离子结合、微管结合、氧化还原酶活性、RAGE受体结合等。后又对全部的差异基因进行KEGG富集性分析。选取与SBD-1表达相关的差异基因pik3r3、Akt、mapk3进行验证,通过RT-qPCR方法、蛋白质印迹方法检测细胞添加10-8mol/L E2后三种基因的表达量逐渐升高,且pik3r3表达量最高值出现在1.5h,在3h表达量也有显著性增高,Akt表达量最高值出现在2.5h,3h表达量也有显著性增加,mapk3表达量最高值出现在2.5h,在3h表达量有显著性增加。通过RT-qPCR方法检测了预孵育PI3K-Akt,MAPK信号通路关键蛋白抑制剂后再添加E2的细胞内SBD-1在不同时间段的表达量变化,验证了E2促进SBD-1的表达需要PI3K-Akt,MAPK两条通路的参与。结论:E2能够促进绵羊输卵管上皮细胞增殖并且能够促进SBD-1的表达。当E2的浓度为10-88 mol/L,体外作用3.5h时,SBD-1的表达量最高;E2可促进绵羊输卵管上皮细胞pik3r3、Akt、mapk3的表达,且表达量最高点分别为1.5h、2.5h和2.5h;E2促进SBD-1表达的非基因组途径通过PI3K-Akt、MAPK信号通路。
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