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以干酪乳杆菌Lactobacillus casei ATCC 393(L.casei 393)作为递呈抗原口服疫苗活菌载体,将猪细小病毒保护性抗原VP2蛋白的基因片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)作为目的基因,构建了共表达猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2蛋白与LTB的重组干酪乳杆菌表达系统,经过动物免疫试验,分析比较了共表达VP2-LTB重组干酪乳杆菌与单独表达VP2重组干酪乳杆菌系统免疫效果及细胞表面表达与分泌表达两种不同表达方式的免疫效果。根据目的基因和融合表达载体质粒的特点,应用Primer Premier 5.0软件进行设计引物。以pMD18-T-VP2质粒和pMD18-T-LTB质粒作为模板,通过PCR扩增分别得到大约1750bp的VP2基因和约375bp的LTB基因,PCR产物经酶切后,胶回收连接,并以连接产物为模板,以VP2的上游引物和LTB的下游引物扩增VP2-LTB,经PCR扩增出约2.1kb的目的基因VP2-LTB,将该基因片段克隆到pMD18-T simple载体,并进行了酶切、PCR鉴定和序列测定,重组质粒命名为pMD18-T-VP2-LTB。重组质粒经BamHI和XhoI双酶切,回收目的基因片段VP2-LTB,分别与经同样双酶切的表达载体pPG-1和pPG-2连接,电转化感受态L.casei 393,筛选阳性克隆,并进行酶切、PCR和测序鉴定,重组质粒命名为pPG-1-VP2-LTB和pPG-2-VP2-LTB,重组干酪乳杆菌命名为pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393和pPG-2-VP2–LTB /L.casei 393。构建的两种重组菌pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393和pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393在MRS培养液中进行培养,以2%乳糖为诱导剂进行目的蛋白的诱导表达。重组菌目的蛋白的表达和定位通过SDS-PAGE、Western blot和免疫荧光及免疫胶体金电镜鉴定。细胞表面表达型重组干酪乳杆菌经诱导后的SDS-PAGE检测结果表明,有约80kD的融合蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot结果分析表明,表达的蛋白可被鼠源PPV抗血清所识别,间接免疫荧光及免疫胶体金电镜实验结果表明,所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌菌体表面检测到;分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后,对诱导表达的菌体及培养上清液进行SDS-PAGE检测表明,有约75kD蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot结果分析所表达的蛋白具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性,实验表明,重组的目的蛋白获得了分泌表达。为检验构建的重组菌是否能诱导黏膜和系统免疫应答以及LTB作为粘膜免疫佐剂的作用,本实验以BALB/c小鼠为试验动物,进行免疫学实验。将BALB/c小鼠分为五组,每组10只,通过口服途径分别免疫接种109活菌量pPG-1/L.casei 393、pPG-1-VP2/L.casei 393、pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393、pPG-2-VP2/L.casei 393、pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393,每隔2w免疫一次,共免疫四次,每次连续免疫3d,一天免疫一次。于免疫前、初次免疫后第7d、21d、35d、49d采集免疫小鼠血液;免疫前、初次免疫后第1d、5d、12d、19d、26d、33d、40d、47d和54d采集免疫口服免疫组小鼠收集粪便;眼洗液和外生殖道洗液是在免疫前、初次免疫后第7d、21d、35d、49d分别以100μl的PBS冲洗眼结膜和冲洗外生殖道获得。所有收集的样品保存于–20℃备用。最后测定了小鼠粪便及眼洗液和外生殖道洗液样品中抗PPV VP2分泌型IgA及小鼠血清样本中抗PPV的特异性IgG水平。通过ELISA方法来检测黏膜样品中特异性分泌型IgA抗体的水平,来评价黏膜免疫反应情况,在粪便、眼洗液和外生殖道洗液中均检测到了高水平的特异性IgA,与对照组相比差异显著。其中,免疫组pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393和pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393的小鼠粪便、眼洗液和外生殖道样品中IgA抗体水平与免疫组pPG-1-VP2/L.casei 393和pPG-2-VP2/L.casei 393相比,差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。初步分析是共表达黏膜免疫佐剂LTB的缘故,表明LTB能加强黏膜系统反应。本研究实验结果初步认为LTB作为一种安全有效的佐剂,具有极大的应用潜力。共表达VP2-LTB重组干酪乳杆菌免疫组与单独表达VP2重组干酪乳杆菌免疫组相比,pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393或pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393中小鼠血清中IgG的效价高于pPG-1-VP2/L.casei 393或pPG-2-VP2/L.casei 393组,与免疫对照组比较,差异显著,并且分泌型的重组菌免疫性更好。在本研究中,口服免疫表达VP2-LTB的重组乳酸菌不仅能诱导产生黏膜免疫,而且诱导产生了系统免疫,并且通过口服免疫产生的黏膜免疫反应不只局限于胃肠道,也引起了其他黏膜部位的免疫反应,而且共表达VP2-LTB组的重组乳酸菌免疫后的sIgA抗体水平高于单独表达VP2组的重组乳酸菌。机体通过分泌性IgA抗体在黏膜表面对病原体进行排斥和清除,这对预防细小病毒感染是至关重要的。中和试验结果表明, pPG-1-VP2/L.casei 393组、pPG-2-VP2/L.casei 393组、pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393组、pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393组在免疫后49d血清的抗体中和效价分别为1:304、1:317、1:338、1:352。本研究首次构建了重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位和猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2蛋白的干酪乳杆菌细胞表面表达和分泌表达系统。本研究所获得的结果表明,干酪乳杆菌可用做口服免疫传递抗原引起黏膜和系统免疫。当VP2蛋白与LTB共表达时,加强了黏膜免疫反应,LTB具有较好的免疫原性、抗原性和佐剂特性,可被用于基因工程疫苗的研制,很适合于用做黏膜疫苗的免疫佐剂。本研究为进一步研究新型、有效的猪细小病毒口服疫苗奠定了基础。